Нуклеаза - Nuclease
А нуклеаза (также архаично известный как нуклеодеполимераза или же полинуклеотидаза) является фермент способный расколоть фосфодиэфирные связи между нуклеотиды из нуклеиновые кислоты. Нуклеазы по-разному действуют Один и двойной многожильные разрывы в их целевых молекулах. В живых организмах они являются важным механизмом для многих аспектов Ремонт ДНК. Дефекты в некоторых нуклеазах могут вызывать генетическая нестабильность или же иммунодефицит.[1] Нуклеазы также широко используются в молекулярное клонирование.[2]
Есть две основные классификации, основанные на локусе активности. Экзонуклеазы переваривать нуклеиновые кислоты с концов. Эндонуклеазы действовать в регионах в середина целевых молекул. Далее они подразделяются на дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. Первый действует на ДНК, последний на РНК.[2]
История
В конце 1960-х годов ученые Стюарт Линн и Вернер Арбер отдельные примеры двух типов ферментов, ответственных за ограничение роста фагов в кишечная палочка (Кишечная палочка ) бактерии.[3][4] Один из этих ферментов добавил метильная группа к ДНК, генерируя метилированная ДНК, в то время как другая расщепляет неметилированную ДНК в самых разных местах по длине молекулы. Первый тип фермента получил название "метилаза "а другой"рестрикционная нуклеаза ". Эти ферментные инструменты были важны для ученых, которые собирали инструменты, необходимые для"вырезать и вставить «Молекулы ДНК. Тогда был нужен инструмент, который бы разрезал ДНК в определенных местах, а не в случайных местах по длине молекулы, чтобы ученые могли разрезать ДНК молекулы предсказуемым и воспроизводимым образом.
Важное событие произошло, когда H.O. Смит, К. Уилкокс и Т.Дж. Келли, работает в Университет Джона Хопкинса в 1968 г. выделил и охарактеризовал первый рестрикционная нуклеаза функционирование которых зависело от конкретной ДНК нуклеотид последовательность. Работаю с Haemophilus influenzae бактерии, эта группа выделила фермент, названный ЗадняяII, которые всегда разрезают молекулы ДНК в определенной точке в определенной последовательности из шести пар оснований. Они обнаружили, что ЗадняяII фермент всегда разрезает непосредственно в центре этой последовательности (между 3-ей и 4-й парами оснований)
Система числовой классификации
Большинство нуклеаз классифицируются по Номер комиссии по ферментам номенклатурного комитета Международный союз биохимии и молекулярной биологии " в качестве гидролазы (EC-номер 3). Нуклеазы принадлежат точно так же, как фосфодиэстераза, липаза и фосфатаза к эстеразы (EC-номер 3.1), подгруппа гидролаз. Эстеразы, к которым принадлежат нуклеазы, классифицируются с номерами ЕС 3.1.11 - ЕС-номерами 3.1.31.
Структура
Нуклеаза первичная структура в общем и целом плохо консервативен и минимально консервативен в активных центрах, поверхности которых в основном состоят из кислотных и основных аминокислотных остатков. Нуклеазы можно разделить на складчатые семейства.[5]
Узнаваемость сайта
Нуклеаза должна связываться с нуклеиновой кислотой, прежде чем она сможет расщепить молекулу. Это влечет за собой определенную степень признания. Нуклеазы по-разному используют как неспецифические, так и специфические ассоциации в способах распознавания и связывания. Оба способа играют важную роль в живых организмах, особенно в репарации ДНК.[6]
Неспецифические эндонуклеазы, участвующие в репарации ДНК, могут сканировать ДНК на наличие целевые последовательности или же повреждать. Такая нуклеаза диффундирует по ДНК до тех пор, пока не встретит мишень, на которую остатки своего активный сайт взаимодействуют с химическими группами ДНК. В случае эндонуклеаз, таких как EcoRV, BamHI и PvuII, это неспецифическое связывание включает электростатические взаимодействия между минимальной площадью поверхности белка и ДНК. Эта слабая ассоциация оставляет общую форму ДНК недеформированной, оставаясь в B-форма.[6]
В отличие от этого, сайт-специфическая нуклеаза образует гораздо более сильные ассоциации. Он втягивает ДНК в глубокую канавку своего ДНК-связывающий домен. Это приводит к значительной деформации ДНК. третичная структура и выполнен с помощью поверхностей, богатых базовый (положительно заряженные) остатки. Он участвует в обширном электростатическом взаимодействии с ДНК.[6]
Некоторые нуклеазы, участвующие в репарации ДНК, проявляют частичную последовательность-специфичность. однако большинство из них являются неспецифическими, вместо этого распознавая структурные аномалии, производимые в ДНК. позвоночник к базовая пара несоответствия.[6]
Структурно-специфическая нуклеаза
Подробнее см. эндонуклеаза лоскута.
Последовательно-специфическая нуклеаза
| Фермент | Источник | Последовательность распознавания | Резать |
|---|---|---|---|
| ЗадняяII | Haemophilus influenzae | 5'– GTYRAC – 3 ' | 5'–GTY RAC–3' |
| R = А или же грамм; Y = C или же Т | |||
Существует более 900 рестрикционных ферментов, некоторые из которых специфичны для последовательности, а некоторые нет, которые были выделены из более чем 230 штаммов бактерий с момента первоначального открытия ЗадняяII. Эти рестрикционные ферменты обычно имеют названия, которые отражают их происхождение - первая буква имени происходит от рода, а вторые две буквы - от вида прокариотической клетки, из которой они были выделены. Например, ЭкоRI происходит от кишечная палочка RY13, а HindII происходит от Haemophilus influenzae штамм Rd. Цифры, следующие за названиями нуклеаз, указывают порядок, в котором ферменты были выделены из отдельных штаммов бактерий: ЭкоRI, ЭкоRII.
Эндонуклеазы
Эндонуклеаза рестрикции функционирует, «сканируя» длину молекулы ДНК. Как только он встречает свою конкретную последовательность распознавания, он связывается с молекулой ДНК и делает по одному разрезу в каждой из двух сахарно-фосфатных цепей. Положения этих двух разрезов как по отношению друг к другу, так и по отношению к самой узнаваемой последовательности определяются идентичностью рестрикционной эндонуклеазы. Различные эндонуклеазы дают разные наборы разрезов, но одна эндонуклеаза всегда будет разрезать определенную последовательность оснований одинаково, независимо от того, на какую молекулу ДНК она действует. После того как надрезы будут сделаны, молекула ДНК разобьется на фрагменты.
Порезка в шахматном порядке
Не все эндонуклеазы рестрикции разрезают симметрично и оставляют тупые концы, как ЗадняяII описано выше. Многие эндонуклеазы расщепляют скелеты ДНК в положениях, которые не находятся прямо напротив друг друга, создавая выступы. Например, нуклеаза ЭкоRI имеет последовательность распознавания 5 '- GAATTC - 3'.
| Фермент | Источник | Последовательность распознавания | Резать |
|---|---|---|---|
| ЗадняяIII | Haemophilus influenzae | 3'– TTCGAA – 5 ' | 3'–TTCGA А–5' |
| ЭкоRI | кишечная палочка | 3'– CTTAAG – 5 ' | 3'–CTTAA грамм–5' |
| БамЗДРАВСТВУЙ | Bacillus amyloliquefaciens | 3'– CCTAGG – 5 ' | 3'–CCTAG грамм–5' |
Когда фермент встречается с этой последовательностью, он расщепляет каждую цепь между G и ближайшими остатками основания A. После того, как разрезы сделаны, полученные фрагменты удерживаются вместе только относительно слабыми водородными связями, которые удерживают комплементарные основания друг к другу. Слабость этих связей позволяет фрагментам ДНК отделяться друг от друга. Каждый полученный фрагмент имеет выступающий 5'-конец, состоящий из непарных оснований. Другие ферменты создают разрезы в основной цепи ДНК, что приводит к выступающим 3 'концам. Выступающие концы - как 3 ', так и 5' - иногда называют "липкие концы "потому что они имеют тенденцию связываться с комплементарными последовательностями оснований. Другими словами, если непарные длины оснований 5'-AATT-3 ' встречает другую непарную длину с последовательностью 3'— ТТАА — 5 ' они будут связаны друг с другом - они «липнут» друг к другу. Лигаза Затем фермент используется для соединения фосфатных скелетов двух молекул. Клеточное или даже видовое происхождение липких концов не влияет на их липкость. Любая пара комплементарных последовательностей будет иметь тенденцию связываться, даже если одна из последовательностей происходит от длины человеческой ДНК, а другая - от длины бактериальной ДНК. Фактически, именно это качество липкости позволяет производить молекулы рекомбинантной ДНК, молекулы, которые состоят из ДНК из разных источников и которые породили генная инженерия технологии.
Роль в природе
Ремонт ДНК
Поскольку все клетки зависят от ДНК как носителя генетической информации, контроль генетического качества является важной функцией всех организмов. Репликация ДНК Это процесс, подверженный ошибкам, а сами молекулы ДНК уязвимы для модификации под действием многих метаболических факторов и факторов окружающей среды. Вездесущие примеры включают активные формы кислорода, возле ультрафиолетовый, и ионизирующего излучения. Многие нуклеазы участвуют в репарации ДНК, распознавая участки повреждения и отщепляя их от окружающей ДНК. Эти ферменты функционируют независимо или в комплексы. Большинство нуклеаз, участвующих в репарации ДНК, неспецифичны для последовательности. Они распознают участки повреждения за счет деформации вторичной структуры двухцепочечной ДНК (дцДНК).[5]
Вычитка репликации
В течение Репликация ДНК, ДНК-полимеразы удлиненный новые цепи ДНК против комплементарных цепей матрицы. Большинство ДНК-полимераз состоят из двух разных ферментативный домены: а полимераза и корректура экзонуклеаза. Полимераза удлиняет новую цепь в направлении 5 '→ 3'. Экзонуклеаза удаляет ошибочные нуклеотиды из той же цепи в направлении 3 ’→ 5’. Эта экзонуклеазная активность важна для способности ДНК-полимеразы к корректуре. Удаления инактивация или удаление этих нуклеаз увеличивает уровень мутаций и смертность пораженных микробы и рак у мышей.[7]
Остановленная вилка репликации
Многие формы Повреждение ДНК остановить развитие вилка репликации, заставляя ДНК-полимеразы и связанные с ними механизмы покинуть вилку. Затем он должен обрабатываться специфичными для вилки белками. Наиболее примечательным является MUS81. Делеции которых вызывают чувствительность к УФ-излучению или метилированию дрожжи, помимо мейотических дефектов.[5]
Обработка фрагментов Окадзаки
Повсеместная задача в клетках - удаление Фрагмент Окадзаки Праймеры РНК от репликации. Большинство таких праймеров вырезано из вновь синтезированных отстающая прядь ДНК эндонуклеазами семейства РНКаза H. В эукариоты И в археи, то эндонуклеаза лоскута FEN1 также участвует в обработке фрагментов Окадзаки.[5]
Исправление несоответствия
Ремонт несоответствия ДНК в любом конкретном организме осуществляется набором специфичных для несовпадения эндонуклеаз. У прокариот эту роль в первую очередь выполняют MutSLH и очень короткий ремонт патчем (Восстановление VSP) ассоциированные белки.
Система MutSLH (включающая MutS, MutL и MutH) исправляет точечные мутации и маленький повороты. MutS распознает несоответствия и связывается с ними, где рекрутирует MutL и MutH. MutL опосредует взаимодействие между MutS и MutH и усиливает эндонуклеазную активность последнего. MutH распознает гемиметилированные 5'-GATC-3 ' сайтов и сколов рядом с грамм неметилированной цепи (недавно синтезированной цепи).
Восстановление VSP инициируется эндонуклеазой Vsr. Он исправляет конкретный Т / г несоответствие, вызванное спонтанным дезаминирование из метилированный цитозины к тиминам. Vsr распознает последовательность 5'— СТW GG — 3 ', где он надрывает цепь ДНК на 5'-стороне несовпадающего тимина (подчеркнута в предыдущей последовательности). Одна из экзонуклеаз RecJ, ExoVII, или же ExoI затем разрушает сайт до того, как ДНК-полимераза повторно синтезирует разрыв в цепи.[5]
Базовая эксцизионная пластика
Сайт AP образование - обычное явление в дцДНК. Это результат спонтанного гидролиза и активности ДНК гликозилазы как промежуточный шаг в базовая эксцизионная пластика. Эти сайты AP удаляются Эндонуклеазы AP, что приводит к разрыву одной нити вокруг сайта.[5]
Эксцизионная репарация нуклеотидов
Эксцизионная репарация нуклеотидов, не путать с эксцизионной репарацией основания, включает удаление и замену поврежденных нуклеотидов. Экземпляры сшивание, аддукты, и поражения (генерируется ультрафиолетовым светом или активные формы кислорода ) может запустить этот путь восстановления. Короткие отрезки одноцепочечной ДНК, содержащие такой поврежденный нуклеотид, удаляются из дуплексной ДНК отдельными эндонуклеазами, воздействующими на разрывы выше и ниже повреждения. Делеции или мутации, влияющие на эти нуклеазы, вызывают повышенную чувствительность к ультрафиолетовому повреждению и канцерогенезу. Такие аномалии могут даже препятствовать развитию нервной системы.
У бактерий оба разреза, выполненные УВРБ-УВРЦ сложный. У бутонизированных дрожжей Rad2 и комплекс Rad1-Rad10 делают 5 'и 3' разрезы соответственно. У млекопитающих гомологи XPG и XPF -ERCC1 влияют на те же самые ники.[8]
Ремонт двуниточного разрыва
Двухниточные разрывы как преднамеренные, так и непреднамеренные, регулярно возникают в камерах. Непреднамеренные перерывы обычно возникают из-за ионизирующего излучения, различные экзогенные и эндогенные химические агенты и вилки остановки репликации. Преднамеренные перерывы возникают как посредники в мейоз и V (D) J рекомбинация, которые в основном ремонтируются гомологичная рекомбинация и негомологичное соединение концов. В обоих случаях требуется, чтобы концы в двухцепочечных разрывах были обработаны нуклеазами, прежде чем может произойти восстановление. Одна из таких нуклеаз - Mre11 в комплексе с Rad50. Мутации Mre11 могут вызывать атаксия-телеангиэктазия -подобное расстройство.[8]
При рекомбинации V (D) J происходит открытие стебель-петли структуры, связанные с двухцепочечными разрывами и впоследствии соединяющими оба конца. В Артемис-ДНАПКcs сложный участвует в этой реакции. Хотя Artemis проявляет экзонуклеазную активность 5 '→ 3' оцДНК в одиночку, ее комплекс с ДНК-ПКcs позволяет производить эндонуклеазную обработку стержней-петель. Дефекты любого из белков вызывают тяжелый иммунодефицит.[8]
С другой стороны, гомологичная рекомбинация включает два гомологичная ДНК дуплексы соединены D-петли или же Праздничные развязки. У бактерий такие эндонуклеазы, как RuvC разрешить Холлидей соединяется в две отдельные дцДНК, расщепляя соединения в двух симметричных местах рядом с центром соединения. У эукариот FEN1, XPF -ERCC1, и MUS81 разрубить D-петли и Cce1 /Ydc2 процессы холлидеевских соединений в митохондриях.[8]
Мегануклеазы
Частота, с которой конкретная нуклеаза будет разрезать данную молекулу ДНК, зависит от сложности ДНК и длины последовательности узнавания нуклеазы; из-за статистической вероятности случайного нахождения оснований в определенном порядке, более длинная последовательность распознавания приведет к менее частому перевариванию. Например, данная последовательность из четырех оснований (соответствующая сайту распознавания для гипотетической нуклеазы), по прогнозам, будет встречаться в среднем каждые 256 пар оснований (где 4 ^ 4 = 256), но любая заданная последовательность из шести оснований будет ожидаемой. встречаться в среднем один раз на каждые 4096 пар оснований (4 ^ 6 = 4096).
Одно уникальное семейство нуклеаз - это мегануклеазы, которые характеризуются более крупными и, следовательно, менее распространенными последовательностями распознавания, состоящими из 12-40 пар оснований. Эти нуклеазы особенно полезны для генной инженерии и Геномная инженерия применения в сложных организмах, таких как растения и млекопитающие, где обычно более крупные геномы (насчитывающие миллиарды пар оснований) приводят к частому и вредному сайт-специфическому перевариванию с использованием традиционных нуклеаз.
Смотрите также
Рекомендации
- ^ Нишино, Тацуя; Морикава, Косуке (2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц для ДНК». Онкоген. 21 (58): 9022–9032. Дои:10.1038 / sj.onc.1206135. PMID 12483517.
- ^ а б Риттье, Лор; Пербал, Бернард (2008). «Ферменты, используемые в молекулярной биологии: полезное руководство». Журнал сотовой связи и сигнализации. 2 (1): 25–45. Дои:10.1007 / s12079-008-0026-2. ЧВК 2570007. PMID 18766469.
- ^ Линн С., Арбер В. (1968). Хозяин-специфичность ДНК, продуцируемой Escherichia coli, X. Ограничение репликативной формы fd фага in vitro. Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 59: 1300-1306
- ^ Арбер В., Линн С. (1969) Модификация и рестрикция ДНК. Анну. Rev. Biochem. 38: 467-500
- ^ а б c d е ж Нишино, Тацуя; Морикава, Косуке (2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц для ДНК». Онкоген. 21 (58): 9022–32. Дои:10.1038 / sj.onc.1206135. PMID 12483517.
- ^ а б c d Нишино, Тацуя; Морикава, Косуке (2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц для ДНК». Онкоген. 21 (58): 9027–9028. Дои:10.1038 / sj.onc.1206135. PMID 12483517.
- ^ Нишино, Тацуя; Морикава, Косуке (2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц для ДНК». Онкоген. 21 (58): 9022, 9023. Дои:10.1038 / sj.onc.1206135. PMID 12483517.
- ^ а б c d Нишино, Тацуя; Морикава, Косуке (2002). «Структура и функция нуклеаз в репарации ДНК: форма, захват и лезвие ножниц для ДНК». Онкоген. 21 (58): 9024, 9025. Дои:10.1038 / sj.onc.1206135. PMID 12483517.
