Фосмид - Fosmid

Фосмиды похожи на космиды но основаны на бактериальный F-плазмида. Вектор клонирования ограничен, поскольку хозяин (обычно Кишечная палочка ) может содержать только одну фосмидную молекулу. Фосмиды могут содержать вставки ДНК размером до 40 т.п.н. часто источником вставки является случайная геномная ДНК. Библиотеку фосмид получают путем извлечения геномной ДНК из организма-мишени и клонирования ее в фосмидный вектор.[1] Затем смесь для лигирования упаковывают в частицы фага, и ДНК трансфицируют в бактериального хозяина. Бактериальные клоны размножают фосмидную библиотеку. Низкое число копий обеспечивает более высокую стабильность, чем векторы с относительно более высоким числом копий, включая космиды. Fosmids могут быть полезны для создания стабильных библиотек из сложных геномы. Фосмиды обладают высокой структурной стабильностью и, как было установлено, эффективно поддерживают ДНК человека даже после 100 поколений бактериального роста.[2] Клоны фосмид использовали для оценки точности общедоступной последовательности генома человека.[3]

Открытие

Плазмида фертильности или F-плазмида был обнаружен Эстер Ледерберг и кодирует информацию для биосинтеза половых пилусов, чтобы способствовать бактериальной конъюгации. Конъюгация включает использование половых пилусов для образования моста между двумя бактериальными клетками; мостик позволяет клетке F + переносить одноцепочечную копию плазмиды, так что обе клетки содержат копию плазмиды. На пути в реципиентную клетку соответствующая цепь ДНК синтезируется реципиентом. Донорская клетка поддерживает функциональную копию плазмиды. Позже было обнаружено, что фактор F был первым эписома и может существовать как независимая плазмида, что делает его очень стабильным вектором для клонирования. Конъюгация способствует формированию библиотек бактериальных клонов, гарантируя, что все клетки содержат желаемую фосмиду.[4]

Фосмиды - это ДНК-векторы, которые используют F-плазмидный ориджин репликации и механизмы разделения, позволяющие клонировать большие фрагменты ДНК. Библиотека, обеспечивающая 20–70-кратное дублирование генома, может быть легко приготовлена.[5]

Библиотеки ДНК

Первым шагом в секвенировании полных геномов является клонирование генома в управляемые единицы длиной примерно 50-200 килобаз. Идеально использовать фосмидную библиотеку из-за ее стабильности и ограничения одной плазмидой на клетку. Ограничивая количество плазмид в клетках, снижается потенциал рекомбинации, таким образом сохраняя вставку генома.[6]

Фосмиды содержат несколько функциональных элементов:

  • OriT (Origin of Transfer): Последовательность, которая отмечает начальную точку сопряженного переноса.
  • OriV (происхождение репликации): последовательность, начиная с которой плазмидная ДНК будет реплицироваться в клетке-реципиенте.
  • tra-region (гены переноса): гены, кодирующие F-Pilus и процесс переноса ДНК.
  • IS (элементы вставки): так называемые «эгоистичные гены» (фрагменты последовательности, которые могут объединять свои копии в разных местах).

Были усовершенствованы методы разрезания и встраивания ДНК в фосмидные векторы. В настоящее время существует множество компаний, которые могут создать фосмидную библиотеку из любого образца ДНК за очень короткий период времени при относительно низких затратах. Это было жизненно важно для того, чтобы исследователи смогли секвенировать многочисленные геномы для изучения. С помощью различных методов было полностью секвенировано более 6651 генома организмов, 58 695 из которых еще продолжаются.[7]

Использует

Иногда сложно точно различить отдельные хромосомы на основе длины хромосомы, соотношения плеч и характера C-полос. Фосмиды можно использовать в качестве надежных цитологических маркеров для индивидуальной идентификации хромосом, а флуоресцентные метафазные хромосомные кариотипы на основе гибридизации in situ можно использовать, чтобы показать, были ли успешно сконструированы положения этих фосмид.[8]

Фосмидная система отлично подходит для быстрого создания хромосомно-специфичных мини-BAC-библиотек из хромосомной ДНК, отсортированной по потоку. Основное преимущество Fosmids перед другими космидными системами заключается в его способности стабильно размножаться фрагментами ДНК человека.[9] Человеческая ДНК с высокой повторяемостью по природе хорошо известна своей крайней нестабильностью в многокопийных векторных системах. Было обнаружено, что стабильность резко возрастает, когда вставки ДНК человека присутствуют в единичных копиях в рекомбинационно-дефицитных Кишечная палочка клетки. Следовательно, фосмиды служат надежными субстратами для крупномасштабного секвенирования геномной ДНК.[2]

использованная литература

  1. ^ Холл BG (май 2004 г.). «Прогнозирование эволюции генов устойчивости к антибиотикам». Обзоры природы. Микробиология. 2 (5): 430–5. Дои:10.1038 / nrmicro888. PMID  15100696.
  2. ^ а б Шизуя Х., Биррен Б., Ким У. Дж., Мансино В., Слепак Т., Тачиири Ю., Саймон М. (сентябрь 1992 г.). «Клонирование и стабильное поддержание фрагментов ДНК человека длиной 300 тыс. Пар оснований в Escherichia coli с использованием вектора на основе F-фактора». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (18): 8794–7. Bibcode:1992PNAS ... 89.8794S. Дои:10.1073 / пнас.89.18.8794. ЧВК  50007. PMID  1528894.
  3. ^ Ким Ю.Дж., Шизуя Х., де Йонг П.Дж., Биррен Б., Саймон М.И. (март 1992 г.). «Стабильное распространение вставок ДНК человека размером с космиду в векторе на основе фактора F». Исследования нуклеиновых кислот. 20 (5): 1083–5. Дои:10.1093 / nar / 20.5.1083. ЧВК  312094. PMID  1549470.
  4. ^ Бауман, Роберт. Микробиология с болезнями по таксономии (3-е изд.). Pearson Education Press. п. 218.
  5. ^ Ким Ю.Дж., Шизуя Х., Сайнс Дж., Гарнес Дж., Пульст С.М., де Йонг П., Саймон М.И. (октябрь 1995 г.). «Построение и полезность библиотеки Fosmid, специфичной для 22 хромосомы человека». Генетический анализ: биомолекулярная инженерия. 12 (2): 81–4. Дои:10.1016/1050-3862(95)00122-0. PMID  8574898.
  6. ^ Гибсон, Грег. Муза, Спенсер. «Букварь геномной науки». Третье издание. Sinauer Associates с.84-85
  7. ^ "JGI GOLD - Дом". gold.jgi-psf.org.
  8. ^ Лю, С. 2010 Кариотипирование дыни (Cucumis melo L.) с помощью межвидовой флуоресценции фосмид in situ Гибридизация, ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  9. ^ Турсун Б., Кочелла Л., Каррера И., Хоберт О. (2009). «Набор инструментов и надежный конвейер для генерации репортерных генов на основе фосмид у C. elegans». PLOS ONE. 4 (3): e4625. Bibcode:2009PLoSO ... 4.4625T. Дои:10.1371 / journal.pone.0004625. ЧВК  2649505. PMID  19259264.

внешние ссылки