Вирусный вектор - Viral vector

Вирусные векторы инструменты, обычно используемые молекулярными биологи доставлять генетический материал в клетки. Этот процесс может происходить внутри живого организма (in vivo ) или в культура клеток (in vitro ). Вирусы развили специализированные молекулярные механизмы для эффективной транспортировки своих геномы внутри клеток они заражают. Доставка гены, или другой генетический материал, вектором называется трансдукция и инфицированные клетки описаны как трансдуцированные. Молекулярные биологи впервые использовали эту технику в 1970-х годах. Пол Берг использовал модифицированный SV40 вирус, содержащий ДНК из бактериофаг λ заразить обезьяну почка клетки сохраняются в культуре.[1]

Помимо использования в исследованиях молекулярной биологии, вирусные векторы используются для генная терапия и развитие вакцина.

Ключевые свойства вирусного вектора

Вирусные векторы адаптированы к их конкретным приложениям, но обычно имеют несколько ключевых свойств.

  • Безопасность: Хотя вирусные векторы иногда создаются из патогенный вирусов, они модифицированы таким образом, чтобы свести к минимуму риск обращения с ними. Обычно это включает удаление части вирусного генома, критически важной для вирусная репликация. Такой вирус может эффективно инфицировать клетки, но, как только заражение произошло, требуется вспомогательный вирус предоставить недостающий белки для производства новых вирионы.
  • Низкая токсичность: Вирусный вектор должен оказывать минимальное влияние на физиология клетки, которую он заражает.
  • Стабильность: Некоторые вирусы генетически нестабильны и могут быстро перестраивать свой геном. Это пагубно сказывается на предсказуемости и воспроизводимости работы, проводимой с использованием вирусного вектора, и этого избегают при их разработке.
  • Специфичность типа клеток: Большинство вирусных векторов сконструированы так, чтобы инфицировать широкий спектр типы клеток насколько возможно. Однако иногда предпочтительнее обратное. Вирусный рецептор можно модифицировать для нацеливания вируса на конкретный вид клетки. Вирусы, модифицированные таким образом, называются псевдотип.
  • Идентификация: Вирусным векторам часто присваиваются определенные гены, которые помогают определить, какие клетки приняли вирусные гены. Эти гены называются маркеры. Обычный маркер сопротивление к определенному антибиотику. Затем клетки могут быть легко изолированы, поскольку те, которые не захватили гены вирусных векторов, не обладают устойчивостью к антибиотикам и поэтому не могут расти в культуре с присутствием соответствующего антибиотика.

Приложения

Фундаментальные исследования

Первоначально вирусные векторы были разработаны как альтернатива трансфекция из голая ДНК за молекулярная генетика эксперименты. По сравнению с традиционными методами, такими как фосфат кальция осадки, трансдукция может гарантировать, что почти 100% клеток инфицированы, не сильно влияя на жизнеспособность клеток. Кроме того, некоторые вирусы интегрировать в камеру геном облегчение стабильного выражения.

Протеин кодирующие гены могут быть выразил с использованием вирусных векторов, обычно для изучения функции конкретного белка. Вирусные векторы, особенно ретровирусы, стабильно экспрессирующие маркерные гены Такие как GFP широко используются для постоянной маркировки клеток для отслеживания их и их потомства, например, в ксенотрансплантация эксперименты, когда клетки заражены in vitro имплантируются животному-хозяину.

Внедрение гена дешевле, чем нокаут гена. Но поскольку молчание иногда неспецифично и оказывает нецелевое воздействие на другие гены, оно дает менее надежные результаты. Векторы животных-хозяев также играют важную роль.

Генная терапия

Основная статья: Генная терапия

Генная терапия - это метод исправления дефектных генов, ответственных за развитие болезни. В будущем, генная терапия может предоставить способ вылечить генетические нарушения, Такие как тяжелый комбинированный иммунодефицит, кистозный фиброз или даже гемофилия А. Потому что эти заболевания возникают в результате мутации В последовательности ДНК для определенных генов в исследованиях генной терапии использовали вирусы для доставки немутантных копий этих генов в клетки тела пациента. Генная терапия добилась огромных успехов в лабораторных условиях. Однако необходимо решить ряд проблем вирусной генной терапии, прежде чем она получит широкое распространение. Иммунная реакция к вирусам не только препятствует доставке генов к клеткам-мишеням, но может вызвать серьезные осложнения для пациента. В одном из первых испытаний генной терапии в 1999 г. это привело к смерти Джесси Гелсингер, который лечился с использованием аденовирусного вектора.[2]

Некоторые вирусные векторы, например гамма-ретровирусы, вставить свои геномы в кажущееся случайным место на одном из хостов хромосомы, которые могут нарушить функцию клеточных генов и привести к раку. В тяжелый комбинированный иммунодефицит ретровирусный генная терапия исследование, проведенное в 2002 году, у четырех пациентов в результате лечения развилось лейкозное заболевание;[3] трое из пациентов выздоровели после химиотерапии.[4] Аденоассоциированные вирусные векторы намного безопаснее в этом отношении, поскольку они всегда интегрируются в одном и том же месте в геноме человека, с применением при различных заболеваниях, таких как Болезнь Альцгеймера. [5]

Вакцина

А живая векторная вакцина это вакцина который использует химически ослабленный вирус транспортировать части патогена, чтобы стимулировать иммунная реакция.[6] Вирусы, выражающие возбудитель белки в настоящее время разрабатываются как вакцина против этих патогенов, исходя из тех же соображений, что и ДНК-вакцины. Гены, используемые в таких вакцинах, обычно антиген кодирование поверхностные белки от патогенный организм. Затем они вставляются в геном непатогенного организма, где они экспрессируются на поверхности организма и могут вызывать иммунный ответ.

Примером может служить вакцина против гепатита В, куда Гепатит Б Инфекция контролируется с помощью рекомбинантной вакцины, которая содержит форму поверхностного антигена вируса гепатита В, продуцируемого в дрожжевых клетках. Разработка рекомбинантной субъединичной вакцины была важной и необходимой разработкой, поскольку вирус гепатита В, в отличие от других распространенных вирусов, таких как вирус полиомиелита, нельзя выращивать in vitro.[7]

Т-лимфоциты распознавать клетки, инфицированные внутриклеточный паразиты на основе чужеродных белков, производимых внутри клетки. Т-клеточный иммунитет имеет решающее значение для защиты от вирусных инфекций и таких заболеваний, как малярия. Вирусная вакцина индуцирует экспрессию белков патогенов в клетках-хозяевах аналогично Сабин Вакцина от полиомиелита и другие аттенуированные вакцины. Однако, поскольку вирусные вакцины содержат лишь небольшую часть генов патогенов, они намного безопаснее, и спорадическое заражение патогеном невозможно. Аденовирусы активно разрабатываются как вакцины.

Типы

Ретровирусы

Основная статья: Ретровирусы

Ретровирусы являются одной из опор современных подходов к генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как Молони вирус лейкемии мышей обладают способностью стабильно интегрироваться в геном хозяина. Они содержат обратная транскриптаза для создания ДНК-копии генома РНК и интегразы, которая позволяет интегрироваться в хозяина геном. Они использовались в ряде одобренных FDA клинических испытаний, таких как SCID-X1 испытание.[8]

Ретровирусные векторы могут быть репликационно-компетентными или репликационно-дефектными. Векторы с дефектом репликации являются наиболее распространенным выбором в исследованиях, поскольку у вирусов кодирующие области для генов, необходимых для дополнительных раундов репликации и упаковки вириона, были заменены другими генами или удалены. Эти вирусы способны инфицировать свои клетки-мишени и доставлять свою вирусную нагрузку, но затем не могут продолжать типичный литический путь, который приводит к лизису и гибели клеток.

Напротив, компетентные к репликации вирусные векторы содержат все необходимые гены для синтеза вирионов и продолжают размножаться после заражения. Поскольку вирусный геном для этих векторов намного длиннее, длина фактически вставленного интересующего гена ограничена по сравнению с возможной длиной вставки для векторов с дефектом репликации. В зависимости от вирусного вектора типичная максимальная длина допустимой вставки ДНК в вирусном векторе с дефектом репликации обычно составляет около 8–10 килобайт.[9] Хотя это ограничивает введение многих геномных последовательностей, большинство кДНК последовательности все еще могут быть размещены.

Основной недостаток использования ретровирусов, таких как ретровирус Молони, заключается в том, что клетки должны активно делиться на трансдукция. В результате такие клетки, как нейроны очень устойчивы к инфекции и трансдукции ретровирусами.

Есть опасения, что инсерционный мутагенез за счет интеграции в хост геном может привести к рак или же лейкемия. Эта проблема оставалась теоретической до тех пор, пока генная терапия в течение десяти лет. SCID-X1 пациенты, использующие Мэлони вирус лейкемии мышей[10] привели к двум случаям лейкемии, вызванной активацией LMO2 онкоген из-за близкого интегрирования вектора.[11]

Лентивирусы

Основная статья: Лентивирус
Упаковка и трансдукция лентивирусным вектором.

Лентивирусы являются подклассом ретровирусов. Иногда их используют как векторы для генной терапии благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток, что является уникальной особенностью лентивирусов, поскольку другие ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки. Вирусный геном в виде РНК является переписанный когда вирус проникает в клетку, чтобы произвести ДНК, который затем вставляется в геном в случайном месте (недавние открытия фактически предполагают, что внедрение вирусной ДНК не является случайным, а направлено на конкретные активные гены и связано с организацией генома).[12]) вирусным интегрировать фермент. Вектор, теперь называемый провирус, остается в геноме и передается потомству клетки при делении. Пока не существует методов определения места интеграции, которые могут создать проблему. В провирус может нарушить функцию клеточных генов и привести к активации онкогены продвижение разработка из рак, что вызывает опасения по поводу возможного применения лентивирусов в генной терапии. Однако исследования показали, что лентивирусные векторы имеют меньшую тенденцию к интеграции в местах, потенциально вызывающих рак, чем гамма-ретровирусные векторы.[13] В частности, одно исследование показало, что лентивирусные векторы не вызывали ни увеличения заболеваемости опухолями, ни более раннего появления опухолей у линии мышей с гораздо более высокой частотой возникновения опухолей.[14] Более того, клинические испытания, в которых использовались лентивирусные векторы для доставки генной терапии для лечения ВИЧ, не показали увеличения мутагенных или онкологических явлений.[15]

По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут гены, необходимые для их репликации. Для получения лентивируса необходимо несколько плазмиды находятся трансфицированный в так называемую упаковку клеточная линия, обычно HEK 293. Одна или несколько плазмид, обычно называемых упаковывающими плазмидами, кодируют вирион белки, такой как капсид и обратная транскриптаза. Другая плазмида содержит генетический материал, который должен быть доставлен вектором. это записано для производства вирусного генома с одноцепочечной РНК и отмечен наличием ψ (psi) последовательность. Эта последовательность используется для упаковки генома в вирион.

Аденовирусы

Основная статья: Аденовирус

В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется при делении клетки. Это ограничивает их использование в фундаментальных исследованиях, хотя аденовирусные векторы все еще используются в in vitro а также in vivo эксперименты.[16] Их основные приложения находятся в генная терапия и вакцинация. Поскольку люди обычно контактируют с аденовирусы, которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, у большинства пациентов уже развились нейтрализующие антитела которые могут инактивировать вирус до того, как он достигнет целевой клетки. Чтобы решить эту проблему, ученые в настоящее время исследуют аденовирусы которые заражают разные виды, к которым у людей нет иммунитета.

Аденоассоциированные вирусы

Основная статья: Аденоассоциированный вирус

Аденоассоциированный вирус (AAV) - небольшой вирус, поражающий людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время не известно, что AAV вызывает заболевание и вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и может включать свой геном в геном клетки-хозяина. Более того, AAV в основном остается как эписомальный (репликация без включения в хромосому); выполняя долгое и стабильное выражение.[17] Эти особенности делают AAV очень привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии.[1] Однако AAV может передавать только до 5 КБ, что значительно меньше по сравнению с исходной емкостью AAV.[18]

Кроме того, из-за его потенциального использования в качестве вектора генной терапии исследователи создали измененный AAV, названный самокомплементарный аденоассоциированный вирус (scAAV). В то время как AAV упаковывает одну цепь ДНК и требует процесса синтеза второй цепи, scAAV упаковывает обе цепи, которые отжигаются вместе с образованием двухцепочечной ДНК. Пропуск синтеза второй цепи scAAV обеспечивает быструю экспрессию в клетке.[19] В остальном scAAV обладает многими характеристиками своего аналога AAV.

Вирусы растений

Основная статья: Вирус растений

Вирусы растений можно использовать для разработки вирусные векторы, инструменты, обычно используемые для доставки генетический материал в завод клетки; они также являются источниками биоматериалов и нанотехнологических устройств.[20][21] Вирус табачной мозаики (TMV) - первый обнаруженный вирус. Вирусные векторы на основе вирус табачной мозаики включать те из magnICON® и технологии экспрессии растений TRBO.[20]

Гибриды

Гибридные векторы вектор вирусы которые генно-инженерный иметь качества более чем одного вектора. Вирусы изменены, чтобы избежать недостатков типичных вирусных векторов, которые могут иметь ограниченную нагрузочную способность, иммуногенность, генотоксичность, и не в состоянии поддерживать долгосрочную адекватную трансгенная экспрессия. За счет замены нежелательных элементов желаемыми способностями гибридные векторы могут в будущем превзойти стандартные векторы трансфекции с точки зрения безопасности и терапевтической эффективности.[22]

Проблемы в приложении

Выбор популярный вектор доставлять генетический Материал в ячейки связан с некоторыми логистическими проблемами. Существует ограниченное количество вирусных векторов, доступных для терапевтического использования. Любой из этих нескольких вирусных векторов может вызвать в организме развитие иммунная реакция если вектор рассматривается как иностранный захватчик.[23][24] После использования вирусный вектор не может быть эффективно использован снова у пациента, потому что он будет распознаваться организмом. Если вакцина или же генная терапия терпит неудачу в клинические испытания, вирус не может быть снова использован у пациента для другой вакцины или генной терапии в будущем. Ранее существовавшие иммунитет против вирусного вектора также может присутствовать у пациента, что делает терапию неэффективной для этого пациента.[23][25] Можно противодействовать существовавшему ранее иммунитету, используя вирусный вектор для вакцинация к грунтовка с невирусным ДНК-вакцина, но этот метод представляет собой дополнительные расходы и препятствия в процессе распространения вакцины.[26] Существующий ранее иммунитет также можно поставить под сомнение, увеличив дозу вакцины или изменив вакцинация маршрут.[27] Некоторые недостатки вирусных векторов (такие как генотоксичность и низкая трансгенная экспрессия) можно преодолеть за счет использования гибридные векторы.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Гофф С.П., Берг П. (декабрь 1976 г.). «Создание гибридных вирусов, содержащих сегменты ДНК фага SV40 и лямбда, и их размножение в культивируемых клетках обезьян». Клетка. 9 (4 PT 2): 695–705. Дои:10.1016/0092-8674(76)90133-1. PMID  189942. S2CID  41788896.
  2. ^ Бердсли Т. (февраль 2000 г.). «Трагическая смерть омрачает будущее инновационного метода лечения». Scientific American.
  3. ^ Макдауэлл Н. (15 января 2003 г.). «Новый случай рака останавливает испытания генной терапии в США». Новый ученый.
  4. ^ Hacein-Bey-Abina S, Hauer J, Lim A, Picard C, Wang GP, Berry CC и др. (Июль 2010 г.). «Эффективность генной терапии Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита». Медицинский журнал Новой Англии. 363 (4): 355–64. Дои:10.1056 / NEJMoa1000164. ЧВК  2957288. PMID  20660403.
  5. ^ Сасмита АО (апрель 2019). «Текущие исследования вирусно-опосредованного переноса генов для лечения болезни Альцгеймера». Обзоры биотехнологии и генной инженерии. 35 (1): 26–45. Дои:10.1080/02648725.2018.1523521. PMID  30317930. S2CID  52978228.
  6. ^ Глоссарий
  7. ^ Информация о вакцинах от Фонда гепатита В В архиве 2011-06-28 на Wayback Machine
  8. ^ Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P и др. (Апрель 2000 г.). «Генная терапия тяжелого комбинированного иммунодефицита человека (SCID) -X1». Наука. 288 (5466): 669–72. Bibcode:2000Sci ... 288..669C. Дои:10.1126 / science.288.5466.669. PMID  10784449.
  9. ^ Вармус, Гарольд; Гроб, Джон М .; Хьюз, Стивен Х., ред. (1997). «Принципы дизайна ретровирусных векторов». Ретровирусы. Плейнвью, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. ISBN  978-0-87969-571-2.
  10. ^ Hacein-Bey-Abina S, Le Deist F, Carlier F, Bouneaud C, Hue C, De Villartay JP и др. (Апрель 2002 г.). «Устойчивая коррекция Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита с помощью генной терапии ex vivo». Медицинский журнал Новой Англии. 346 (16): 1185–93. Дои:10.1056 / NEJMoa012616. PMID  11961146.
  11. ^ Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP, Wulffraat N, Leboulch P, et al. (Октябрь 2003 г.). «LMO2-ассоциированная пролиферация клональных Т-клеток у двух пациентов после генной терапии SCID-X1». Наука. 302 (5644): 415–9. Bibcode:2003Наука ... 302..415H. Дои:10.1126 / science.1088547. PMID  14564000. S2CID  9100335.
  12. ^ Марини Б., Кертес-Фаркас А., Али Х., Лючич Б., Лисек К., Манганаро Л. и др. (Май 2015 г.). «Ядерная архитектура диктует выбор места для интеграции ВИЧ-1». Природа. 521 (7551): 227–31. Bibcode:2015Натура.521..227М. Дои:10.1038 / природа14226. PMID  25731161. S2CID  974969.
  13. ^ Каттольо С., Факкини Дж., Сартори Д., Антонелли А., Миччио А., Кассани Б. и др. (Сентябрь 2007 г.). «Горячие точки интеграции ретровирусов в человеческие CD34 + гематопоэтические клетки». Кровь. 110 (6): 1770–8. Дои:10.1182 / кровь-2007-01-068759. PMID  17507662.
  14. ^ Montini E, Cesana D, Schmidt M, Sanvito F, Ponzoni M, Bartholomae C и др. (Июнь 2006 г.). «Перенос гена гемопоэтических стволовых клеток на мышиной предрасположенной к опухоли модели раскрывает низкую генотоксичность интеграции лентивирусного вектора». Природа Биотехнологии. 24 (6): 687–96. Дои:10.1038 / nbt1216. PMID  16732270. S2CID  8966580.
  15. ^ Lidonnici MR, Paleari Y, Tiboni F, Mandelli G, Rossi C, Vezzoli M и др. (Декабрь 2018 г.). «Множественные интегрированные доклинические исследования предсказывают безопасность опосредованной лентивирусами генной терапии β-талассемии». Молекулярная терапия. Методы и клинические разработки. 11: 9–28. Дои:10.1016 / j.omtm.2018.09.001. ЧВК  6178212. PMID  30320151.
  16. ^ Рамос-Кури М., Рапти К., Мехел Х., Чжан С., Дхандапани П.С., Лян Л. и др. (Ноябрь 2015 г.). «Доминирующий отрицательный Ras ослабляет патологическое ремоделирование желудочков при гипертрофии сердца при перегрузке давлением». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Исследование молекулярных клеток. 1853 (11 Pt A): 2870–84. Дои:10.1016 / j.bbamcr.2015.08.006. ЧВК  4715892. PMID  26260012.
  17. ^ Нуссбаум, Роберт Л; Макиннес, Родерик Р.; Уиллард, Хантингтон Ф (2015). Томпсон и Томпсон Генетика в медицине. Канада: ЭЛЬСЕВЬЕР. п. 278. ISBN  978-1-4377-0696-3.
  18. ^ Бак Р.О., Портеус М.Х. (июль 2017 г.). «CRISPR-опосредованная интеграция больших генных кассет с использованием донорных векторов AAV». Отчеты по ячейкам. 20 (3): 750–756. Дои:10.1016 / j.celrep.2017.06.064. ЧВК  5568673. PMID  28723575.
  19. ^ Маккарти Д.М., Монахан П.Е., Самульски Р.Дж. (август 2001 г.). «Самокомплементарные векторы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (scAAV) способствуют эффективной трансдукции независимо от синтеза ДНК». Генная терапия. 8 (16): 1248–54. Дои:10.1038 / sj.gt.3301514. PMID  11509958.
  20. ^ а б Авраамян, Петр; Хаммонд, Розмари В .; Хаммонд, Джон (2020-06-10). "Переносчики вирусов растений: применение в сельскохозяйственной и медицинской биотехнологии". Ежегодный обзор вирусологии. 7. Дои:10.1146 / annurev-virology-010720-054958. ISSN  2327-0578. PMID  32520661.
  21. ^ Пасин, Фабио; Menzel, Wulf; Дарос, Хосе-Антонио (июнь 2019 г.). «Запрещенные вирусы в эпоху метагеномики и синтетической биологии: обновленная информация о сборке инфекционных клонов и биотехнологиях вирусов растений». Журнал биотехнологии растений. 17 (6): 1010–1026. Дои:10.1111 / pbi.13084. ISSN  1467-7652. ЧВК  6523588. PMID  30677208.
  22. ^ Хуанг С., Камихира М. (2013). «Разработка гибридных вирусных векторов для генной терапии». Достижения биотехнологии. 31 (2): 208–23. Дои:10.1016 / j.biotechadv.2012.10.001. PMID  23070017.
  23. ^ а б Наяк С., Херцог Р.В. (март 2010 г.). «Прогресс и перспективы: иммунный ответ на вирусные векторы». Генная терапия. 17 (3): 295–304. Дои:10.1038 / gt.2009.148. ЧВК  3044498. PMID  19907498.
  24. ^ Чжоу Х.С., Лю Д.П., Лян СС (ноябрь 2004 г.). «Проблемы и стратегии: иммунные ответы в генной терапии». Обзоры медицинских исследований. 24 (6): 748–61. Дои:10.1002 / med.20009. PMID  15250039. S2CID  17622444.
  25. ^ Crommelin DJ, Sindelar RD, Meibohm B (2008). Фармацевтическая биотехнология: основы и применение. Лондон: Тейлор и Фрэнсис. ISBN  978-1420044379.
  26. ^ Ян З.Й., Вятт Л.С., Конг В.П., Муди З., Мосс Б., Набель Г.Дж. (январь 2003 г.). «Преодоление иммунитета к вирусной вакцине путем праймирования ДНК перед векторным бустингом». Журнал вирусологии. 77 (1): 799–803. Дои:10.1128 / JVI.77.1.799-803.2003. ЧВК  140625. PMID  12477888.
  27. ^ Панди А., Сингх Н., Вемула С.В., Куэтил Л., Кац Дж. М., Донис Р. и др. (2012). Субвия Э (ред.). «Влияние существующего иммунитета к аденовирусному вектору на иммуногенность и защиту, обеспечиваемую вакциной против гриппа H5N1 на основе аденовируса». PLOS ONE. 7 (3): e33428. Bibcode:2012PLoSO ... 733428P. Дои:10.1371 / journal.pone.0033428. ЧВК  3303828. PMID  22432020.

внешняя ссылка