Клиническое метагеномное секвенирование - Clinical metagenomic sequencing

Клиническое метагеномное секвенирование нового поколения (mNGS) комплексный анализ генетического материала микробов и хозяев (ДНК или РНК ) в образцах от пациентов. Это позволяет идентифицировать и геномную характеристику бактерии, грибы, паразиты, и вирусы без необходимости предварительного знания конкретного патогена непосредственно из клинических образцов.[1] Способность обнаруживать весь потенциал патогены в образце делает метагеномное секвенирование следующего поколения мощным инструментом в диагностике инфекционных заболеваний, особенно когда используются другие более направленные анализы, такие как ПЦР провал.[2] Текущие ограничения включают клиническую применимость, лабораторную валидность, чувство и чувствительность, стоимость и нормативные требования.

Рабочий процесс лаборатории

Типичный рабочий процесс mNGS состоит из следующих шагов:

  • Получение образца: наиболее часто используемые образцы для метагеномного секвенирования: кровь, стул, спинномозговая жидкость (CSF), моча, или мазки из носоглотки. Среди них кровь и спинномозговая жидкость являются самыми чистыми, с меньшим фоновым шумом, в то время как в остальных ожидается большое количество комменсалов и / или оппортунистические инфекции и, следовательно, иметь больше фонового шума.[3] Образцы следует собирать с большой осторожностью, поскольку хирургические образцы могут быть загрязнены во время работы с ними. биопсия; например, люмбальные проколы для получения образцов спинномозговой жидкости могут быть загрязнены во время процедуры.[2]
  • Экстракция РНК / ДНК: ДНК и РНК образца экстрагируются с помощью набора для экстракции. Если есть сильные предыдущие подозрения относительно состава генома патогена и поскольку количество нуклеиновой кислоты патогена в большем количестве шумовых образцов превышает РНК / ДНК других организмов, выбор набора для экстракции только РНК или ДНК будет более конкретным и удобный подъезд. Некоторыми коммерчески доступными наборами являются, например, набор RNeasy PowerSoil Total RNA (Qiagen ), RNeasy Minikit (Qiagen), MagMAX Viral Isolation Kit (ABI), Viral RNA Minikit (Qiagen).[3]
  • Стратегии оптимизации подготовки библиотеки: из-за высоких уровней фонового шума при метагеномном секвенировании было разработано несколько процедур обогащения мишеней, направленных на повышение вероятности захвата транскриптов и / или геномов, полученных от патогенов. Как правило, есть два основных подхода, которые можно использовать для увеличения количества сигнала патогена в образце: отрицательный отбор и положительное обогащение.[3][1]
  1. Отрицательный отбор (истощение или вычитание фона) нацелен и устраняет геномный фон хозяина и микробиома, стремясь при этом сохранить нуклеиновую кислоту, полученную из представляющих интерес патогенов. Деградация геномного фона может осуществляться путем переваривания широкого спектра нуклеазы, такие как ДНКаза I для фона ДНК, или путем удаления многочисленных видов РНК (рРНК, мтРНК, глобин-мРНК) с использованием наборов для удаления специфичных для последовательности РНК. Также CRISPR-Cas9 подходы на основе могут быть выполнены, например, для нацеливания и истощения митохрондриальной РНК человека. Однако обычно методы вычитания приводят к определенной степени потери целевого генома патогена, так как во время очистки может произойти плохое восстановление.[3]
  2. Положительное обогащение используется для усиления сигнала патогена, а не для уменьшения фонового шума. Обычно это делается через гибридизация захват мишени зондами, которые используются для извлечения интересующей нуклеиновой кислоты для последующей амплификации и секвенирования. Было показано, что панвирусные зонды успешно идентифицируют различные типы патогенов в различных клинических жидкостях и респираторных образцах и используются для секвенирования и характеристики новых вирусов. Однако зондовый подход включает в себя дополнительные этапы гибридизации и очистки, требующие более высокого ввода пробы, повышающие риск потери цели и увеличивающие стоимость и время работы.[3]
  • Высокопроизводительное секвенирование: все фрагменты нуклеиновых кислот библиотеки секвенированы. Используемая платформа для секвенирования выбирается в зависимости от различных факторов, таких как цели лабораторных исследований, личный опыт и уровень навыков. Пока что Illumina MiSeq Система зарекомендовала себя как наиболее часто используемая платформа для исследования инфекционных заболеваний, надзора за патогенами и обнаружения патогенов в исследованиях и в сфере общественного здравоохранения. Этот прибор достаточно компактен, чтобы поместиться на лабораторном столе, имеет быстрое время работы по сравнению с другими аналогичными платформами и имеет сильное сообщество пользователей. Однако с дальнейшими улучшениями этой технологии, дополнительным снижением ошибок и программной стабилизацией Миньон может стать отличным дополнением к арсеналу современных технологий секвенирования для рутинного эпиднадзора, особенно в небольших лабораториях с ограниченными ресурсами. Например, MinION успешно использовался в проекте ZiBRA для реального времени. Вирус Зика наблюдение за комары и люди в Бразилия, И в Гвинея для выполнения наблюдения в реальном времени во время текущего Эбола вспышка.[4][5] Как правило, для ограниченных ресурсов используются IlluminaMiSeq, iSeq, Ion Torrent PGM, Oxford Nanopore, MinION. В то время как для значительных ресурсов предпочтительны Illumina NextSeq, NovaSeq, PacBio Sequel, Oxford Nanopore и PromethION. Более того, для секвенирования патогенов использование контролей имеет фундаментальное значение, обеспечивая качество и стабильность анализа mNGS во времени; PhiX используется в качестве контроля секвенирования, затем другие контроли включают положительный контроль, дополнительный внутренний контроль (например, ДНК с добавками или другой известный патоген) и отрицательный контроль (обычно образец воды).[3]
  • Биоинформатический анализ: Несмотря на то, что само определение последовательности стало широко доступным и более удобным для пользователя, последующий анализ и интерпретация данных по-прежнему требует специализированных биоинформатика опыт и соответствующие вычислительный Ресурсы. Необработанные данные с платформы секвенирования обычно очищаются, обрезаются и фильтруются для удаления некачественных и повторяющихся считываний. Удаление хоста геном /транскриптом Считывание выполняется для уменьшения фонового шума (например, считывания от хозяина и окружающей среды) и увеличения частоты считывания патогенов. Этот шаг также уменьшит время последующего анализа. Дальнейшее устранение фонового шума достигается путем сопоставления считываний образцов с показаниями отрицательного контроля, чтобы гарантировать устранение любых загрязняющих считываний, например связанных с реагентами или средой для хранения образцов. Остальные чтения обычно собираются de novo для получения длинных отрезков последовательностей, называемых контиги. Таксономический идентификация полученных контигов осуществляется путем сопоставления их с геномами и последовательностями в базах данных нуклеотидов или белков; для этого используются различные версии ВЗРЫВ наиболее часто используются. Также может быть проведена расширенная характеристика бактериальных организмов, что позволит получить необходимую глубину и широту охвата результатов генетической характеристики. Вызов генов может выполняться различными способами, включая RAST или использование NCBI услуги во время представления полного генома. Результаты нескольких инструментов аннотации можно сравнить на предмет точности и полноты и, при необходимости, объединить с помощью BEACON. Для характеристики генов устойчивости к антибиотикам используйте идентификатор гена устойчивости из Полная база данных устойчивости к антибиотикам (КАРТА) обычно используется. Для характеристики генов факторов вирулентности ShortBRED предлагает анализ с настраиваемой базой данных из Базы данных факторов вирулентности.[3]

Приложения

Метагеномные подходы использовались для выявления инфекций в древних останках, обнаружения новых вирусных патогенов и характеристики вирома человека как в здоровом, так и в болезненном состоянии, а также для судебно-медицинских исследований.[1]

В частности, применение клинической метагеномики на сегодняшний день включало диагностику инфекционных заболеваний для различных синдромов и типов образцов, анализ микробиома как в болезненном, так и в здоровом состоянии, характеристику реакции человеческого хозяина на инфекцию с помощью транскриптомики и идентификацию опухолевых вирусов и их геномная интеграция sittes.[1]

Помимо диагностики инфекционных заболеваний, внедрение mNGS (метагеномное секвенирование следующего поколения) в клинических лабораториях происходит медленно, и большинство приложений еще предстоит внедрить в повседневную клиническую практику. Тем не менее, широта и потенциальная клиническая полезность этих приложений, вероятно, в ближайшем будущем изменит сферу диагностической микробиологии.[1]

Диагностика инфекционных заболеваний

Способность обнаруживать все потенциальные патогены (бактерии, вирусы, грибки и паразиты) в образце и одновременно исследовать ответы хозяина имеет большую потенциальную пользу при диагностике инфекционных заболеваний. Одним из способов обнаружения этих патогенов является определение части их генома с помощью секвенирования метагеномики (Секвенирование следующего поколения -mNGS), которые могут быть целевыми или нецелевыми.[1]

Целевые

Целевой анализ выполняется путем обогащения отдельных генов или участков генома. Такой подход значительно увеличивает количество патогенов. читает в данных последовательности. Из-за этого чувствительность к обнаружению микроорганизмов, на которые нацелены, обычно повышается, но это связано с ограничением круга потенциальных патогенов, которые могут быть идентифицированы.[1]

Нецелевой

Нецелевой анализ - это метагеномный "дробовик" подход. Вся ДНК и / или РНК секвенируются с помощью этого подхода с использованием универсального грунтовки. Результирующие чтения mNGS могут быть собраны в частичные или полные геномы. Эти последовательности генома позволяют отслеживать вспышки заболеваний в больницах для облегчения инфекционного контроля и наблюдения за здоровьем населения. Также их можно использовать для определения подтипов (идентификации конкретного генетического варианта микроорганизма).

Ненаправленный mNGS - самый многообещающий подход для анализа клинических образцов и обеспечения комплексной диагностики инфекций. Различные группы одобрили mNGS в Поправках по улучшению клинической лаборатории (CLIA ), таких как менингит или энцефалит, сепсис и пневмония.[1]

Традиционный метод заключается в постановке дифференциального диагноза на основе истории болезни пациента, клинической картины, результатов визуализации и лабораторных исследований. Но здесь предлагается другой способ диагностики; метагеномный Секвенирование следующего поколения (NGS) является многообещающим методом, поскольку с помощью одного анализа можно определить полный спектр потенциальных причин (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных).[1]

Ниже приведены некоторые примеры применения метагеномного секвенирования в диагностике инфекционных заболеваний.

Примеры

Диагностика менингита и энцефалита

Традиционный метод, который используется для диагностики инфекционных заболеваний, в некоторых случаях подвергается сомнению: нейровоспалительные заболевания, отсутствие диагностических тестов на редкие патогены и ограниченная доступность и объем Центральная нервная система (ЦНС) образцы из-за необходимости инвазивных процедур. Из-за этих проблем некоторые анализы предлагают другой способ диагностики, который метагеномный секвенирование нового поколения (NGS); это многообещающий метод диагностики, поскольку с помощью одного исследования можно определить широкий спектр потенциальных причин (бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных). Подводя итог, можно сказать, что NGS может идентифицировать широкий спектр патогенов в одном тесте.[6]

В некоторых статьях они оценивают клиническую полезность метагеномного NGS для диагностики неврологических инфекций параллельно с обычным микробиологическим тестированием. Было замечено, что самый высокий диагностический результат был получен в результате комбинации метагеномного NGS CSF и обычного тестирования, включая серологическое тестирование и тестирование типов образцов, отличных от CSF.[6]

Более того, некоторые результаты различных исследований показали, что неврологические инфекции остаются недиагностированными у части пациентов, несмотря на обычное тестирование, и демонстрируют потенциальную полезность клинического метагеномного тестирования NGS у этих пациентов.[6]

Результаты метагеномного NGS также могут быть ценными, даже если они согласуются с результатами обычного тестирования, не только обеспечивая уверенность в правильности диагноза, полученного обычным путем, но также потенциально обнаруживая или исключая коинфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом.[6]

Метагеномика - это, по сути, метод прямого обнаружения, основанный на присутствии нуклеиновой кислоты, образующей возбудитель, в образцах спинномозговой жидкости.[6]

Исследование устойчивости к противомикробным препаратам

Устойчивость к противомикробным препаратам проблема со здоровьем, которую необходимо решить.[7]

В настоящее время для определения устойчивости различных микробов используется метод, называемый Чувствительность к антибиотикам (АСТ), но несколько исследований показали, что резистентность бактерий находится в геноме и передается через горизонтальный путь (HGT), поэтому разрабатываются методы секвенирования для упрощения идентификации и характеристики этих геномов и метагеномов. На данный момент существуют следующие методы определения устойчивости к противомикробным препаратам:[7]

  • AST: Преимущество этого метода в том, что он дает информацию для лечения пациентов. Есть также некоторые недостатки, один из которых заключается в том, что этот метод полезен только для культивируемых бактерий или что требуется компетентный персонал.[7]
  • Методы секвенирования: Некоторые преимущества этих методов перед техникой AST заключаются в том, что они быстрые и разумные, они полезны как для бактерий, которые растут на искусственных средах, так и на тех, которые не растут, и позволяют сравнивать исследования на нескольких организмах. Один тип метода секвенирования может быть предпочтительнее другого в зависимости от типа образца для геномного образца. методы на основе сборки используется; для метагеномного образца предпочтительно использовать методы на основе чтения.[7]

Отмечено, что методы метагеномного секвенирования дали лучшие результаты, чем методы геномики, за счет меньшего количества отрицательных ошибок. В рамках секвенирования метагеномики функциональный метагеномик является мощным подходом для характеристики резистомы; а метагеномная библиотека генерируется путем клонирования общей ДНК сообщества, выделенной из образца, в вектор выражения, эту библиотеку исследуют на устойчивость к противомикробным препаратам путем посева на селективную среду, которая является летальной для хозяина дикого типа. Выбранные вставки из выживших рекомбинантных, устойчивых к противомикробным препаратам клеток-хозяев затем секвенируются, и полученные последовательности впоследствии собираются и аннотируются. (ПАРФЮМЫ).[7]

Функциональная метагеномика позволила открыть несколько новых механизмов устойчивости к противомикробным препаратам и связанных с ними генов, одним из таких примеров является недавно открытый тетрациклин механизм резистентности тетрациклиновыми деструктазами.[7]

В заключение важно включить не только последовательность и механизм гена устойчивости к противомикробным препаратам, но также геномный контекст, виды бактерий-хозяев и географическое положение (метагеном ).[7]

Клинические анализы микробиома

В последнее время произошел переход от целевого секвенирования гена 16S рРНК к использованию mNGS для характеристики микробиома человека. Это идет рука об руку с повышением осведомленности о важной роли микробиома в различных состояниях болезней. Несмотря на то, что ни один тест на микробиом не был одобрен для диагностики или лечения заболевания. В основном это связано с неполным пониманием сложности микробиома и того, как он связан с некоторыми заболеваниями.[1]

Использование mNGS для характеристики микробиома сделало возможным разработку бактериальных пробиотиков, которые можно вводить в виде таблеток, например, для лечения Clostridium difficile -ассоциированные заболевания.[1]

Еще одним применением микробиома является анализ бактериального разнообразия. Он может дать информацию о том, является ли заболевание заразным или нет. Исследования mNGS показывают, что пациенты с подтвержденной культурой инфекции (например, у пациентов с пневмонией) имеют меньшее разнообразие респираторного микробиома. Это связано с дисбактериоз, аномальное изменение микробиома, которое также может быть связано с ожирением, сахарным диабетом или воспалительным заболеванием кишечника. Выявление дисбактериоза с помощью mNGS может быть путем к лечению этих патологических состояний путем последующего манипулирования микробиомом.[1]

Анализ реакции человека-хозяина

Знание ответов хозяина имеет важное перспективное значение при диагностике инфекционных заболеваний. По этой причине одним из наиболее важных возможных приложений клинической метагеномики является характеристика реакции человека-хозяина на инфекцию с помощью транскриптомика и идентификация вирусов, ассоциированных с опухолью, и сайтов их геномной интеграции.[1]

Изучение экспрессии генов позволяет охарактеризовать множество инфекций, например инфекции, вызванные Золотистый стафилококк, Болезнь Лайма, кандидоз, туберкулез и грипп. Также этот подход можно использовать для рак классификация.

mNGS библиотек РНК, используемых для обнаружения патогенов, таких как РНК-вирусы, в клинических образцах, случайно дает данные об экспрессии генов хозяина для анализ транскриптома (RNAseq). Существуют анализы, не основанные на RNAseq, которые на сегодняшний день клинически подтверждены для использования у пациентов, но анализ RNAseq дает лучшие результаты. Причина в том, что анализы RNAseq могут обнаруживать активную экспрессию микробных генов и могут позволить различать инфекцию и колонизацию, а также живые и мертвые организмы.[1]

Анализ RNAseq имеет множество других целей и применений, таких как выявление новых или недооцененных взаимодействий между хозяином и микробом непосредственно из клинических образцов, постановка косвенного диагноза на основе патоген-специфической реакции человека-хозяина и различение инфекционных и неинфекционных причин острого заболевания. болезнь.[1]

Приложения в онкологии

В онкологии полногеномные или направленные подходы NGS для идентификации мутировавших генов могут использоваться для одновременного обнаружения вирусов, связанных с раком (например, вирусов герпеса, папилломавирусов и полиомавирусов), и / или для сбора информации о взаимодействии между вирусом и его хозяином.[1]

До сих пор США Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрила клиническое использование двух панелей NGS для тестирования действенных геномных аберраций в образцах опухолей.[1] Добавление специфических вирусных зондов позволяет обнаруживать считывания, соответствующие как интегрированным, так и экзогенным вирусам. Собранные данные об интегрированных или активных вирусных инфекциях при раке важны для профилактического или терапевтического лечения целевыми противовирусными и химиотерапевтическими препаратами.[1]

В будущем mNGS бесклеточной ДНК из жидкого биопсийного образца, такого как плазма, может быть полезен для выявления рака на ранних стадиях и диагностики инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом.[1]

Вызовы

Несмотря на потенциал и недавние успехи метагеномики, клиническая диагностика приложения отстали исследование успехи благодаря ряду факторов. Сложное взаимодействие микробных факторов и факторов хозяина влияет на человеческое здоровье, как показано на примере роли микробиома в модулировании иммунные ответы хозяина, и часто неясно, является ли обнаруженный микроорганизм контаминантом, колонизатором или патогеном. Кроме того, отсутствуют универсальные эталонные стандарты и проверенные подходы для демонстрации валидации, воспроизводимости и гарантии качества клинических метагеномных анализов. Соображения стоимости, возмещения, времени выполнения, нормативных требований и, что, возможно, наиболее важно, клинической полезности, также остаются серьезными препятствиями для рутинного внедрения клинических мНГС в учреждениях по уходу за пациентами.[1]

Клиническая полезность

Молекулярные диагностические тесты предоставляют достаточно экономичные и быстрые (около 2 часов рабочего времени) средства для диагностики наиболее распространенных инфекций. Однако почти все обычные микробиологические тесты, используемые в настоящее время, выявляют только один или ограниченную группу патогенов за раз или требуют, чтобы микроорганизм был успешно культивирован из клинического образца. Напротив, в то время как используемые в настоящее время тесты NGS не могут сравниться с обычными тестами в отношении скорости (только цикл секвенирования на стандартном приборе Illumina занимает> 18 часов), mNGS может активировать широкий спектр патогенов (вирусы, бактерии, грибки и / или паразиты). ) для идентификации из культуры или непосредственно из клинических образцов на основе однозначно идентифицируемых последовательностей ДНК и / или РНК.[1]

На сегодняшний день несколько исследований дали представление о перспективах NGS в клинических условиях и в условиях общественного здравоохранения.[1] Несмотря на то, что большинство полученных данных о результатах метагеномики состоит из отчеты о случаях что опровергает растущий интерес к диагностической метагеномике.[8] Например, NGS использовался для клинической диагностики нейролептоспироз у 14-летнего тяжелобольного мальчика с менингоэнцефалитом; этот случай был первым, кто продемонстрировал возможную полезность метагеномного NGS (mNGS) в предоставлении клинически действенной информации, успешный диагноз вызвал соответствующие целевые лечение антибиотиками и возможное выздоровление пациента.[1]

Таким образом, аргумент в пользу клинической полезности метагеномного метода в конечном итоге основан только на наиболее трудно диагностируемых случаях или для пациентов с ослабленным иммунитетом, у которых спектр потенциальных патогены лучше.[1] Соответственно, отсутствует проникновение этого подхода в лабораторию клинической микробиологии, поскольку диагноз с метагеномикой все еще в основном полезен только в контексте истории болезни, но не для истинной ежедневной диагностической цели.[8]

Недавнее моделирование экономической эффективности метагеномики в диагностике высокая температура неизвестного происхождения пришли к выводу, что даже после ограничения стоимости диагностической метагеномики 100–1000 долларов за тест, это потребует в 2,5–4 раза большей диагностической эффективности компьютерная томография живота / таза чтобы не зависеть от затрат и предостеречь от «повсеместной поспешности» развертывания метагеномного тестирования.[8] В конце концов, mNGS может стать конкурентоспособным по стоимости по сравнению с мультиплексными анализами или использоваться в качестве предварительного анализа для исключения инфекционных заболеваний. этиологии. Но на данный момент клиническая метагеномика недостаточно эффективна.[1]

Кроме того, в случае обнаружения потенциального романа инфекционные агенты, обычно публикуются только положительные результаты, хотя подавляющее большинство секвенированных случаев являются отрицательными, что приводит к очень предвзятой информации. Кроме того, в большинстве открытий, основанных на метагеномике, которые предшествуют текущей диагностической работе, даже упоминаются известные агенты, обнаруженные при скрининге нераскрытых случаев на совершенно новые причины.[8]

Конечно, обнаружение нуклеиновых кислот с помощью NGS или мультиплексных анализов само по себе не доказывает, что идентифицированный микроорганизм является причиной болезнь, а полученные данные следует интерпретировать в клиническом контексте. В частности, обнаружение атипичного или нового инфекционного агента в клинических образцах должно сопровождаться подтверждающими исследованиями, такими как ортогональное тестирование из биопсия ткани образцы и демонстрация сероконверсия или с помощью культура клеток или животные модели, при необходимости, чтобы установить его истинный патогенный потенциал.[1]

Несмотря на все это, область страдает отсутствием понимания истинной клинической полезности.

Лабораторная валидность

На сегодняшний день большинство опубликованных тестов было проведено без проверки и без предоставления отчетов. «Стандартные микробиологические исследования», которым образцы подвергаются перед метагеномикой, варьируются и не включают полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) тестирование на распространенные респираторные вирусы или стандартное тестирование 16S / ITS PCR.[8]

Учитывая относительную стоимость проверки и проведения метагеномного тестирования по сравнению с тестированием ПЦР с 16S / ITS, второй вариант считается более простым и эффективным. Потенциальным исключением из теста 16S / ITS является кровь, учитывая огромное количество доступной последовательности 16S, что делает точные отсечки для диагностических целей проблематичными.[8]

Кроме того, почти все организмы, обнаруженные метагеномикой, для которых существует связанное лечение и, таким образом, могут быть действительно действенными, также обнаруживаются с помощью тестирования 16S / ITS (или 16S / ITS-NGS). Это ставит под сомнение полезность метагеномики во многих диагностических случаях.[8]

Одним из основных моментов для достижения лабораторной валидности является наличие эталоны и контроль при выполнении анализов mNGS. Они необходимы для обеспечения качества и стабильности этой техники с течением времени.[1]

Большинство доступных метагеномных справочных материалов предназначены для конкретных приложений (например, ZymoBIOMICS Microbial Community Standard [1] для анализа микробиома и бактериальной и грибковой метагеномики) и / или сосредоточены на более ограниченном спектре организмов (например, Национальный институт стандартов и технологий (NIST)[2] справочные материалы для обнаружения смешанной микробной ДНК, которые содержат только бактерии) Таким образом, эти материалы могут быть неприменимы для нецелевых анализов mNGS.

Пользовательские смеси, состоящие из пула микроорганизмов (имитация микробных сообществ) или их нуклеиновых кислот, могут быть разработаны в качестве внешнего контроля для установления пределов обнаружения для тестирования mNGS. Внутренний всплеск стандарты контроля доступны для других приложений секвенирования следующего поколения, таких как анализ транскриптома с помощью RNA-seq.[1]

Тем не менее, отсутствие общепринятых эталонов для mNGS затрудняет сравнение результатов анализа в разных лабораториях. Существует острая необходимость в стандартизированных эталонных организмах и геномных материалах для облегчения таких сравнений и определения оптимальных методов анализа.[1]

Чувство и чувствительность

В клиническая микробиология лабораторий, количественное определение микробной нагрузки считается рутинной функцией, поскольку оно связано с серьезностью и прогрессированием заболевания. Чтобы добиться хорошего количественное определение высота чувствительность техники.[8]

Ключевым ограничением метагеномного секвенирования следующего поколения (mNGS) является его пониженная чувствительность с высоким уровнем фона, поскольку они могут иметь клиническое значение, поскольку нагрузка патогенов при инфекциях может быть очень низкой.[1] В то время как мешающие вещества представляют собой общую проблему для клиническая химия или для ПЦР-диагностики степень вмешательства со стороны хоста (например, в биопсия тканей ) или непатогенных нуклеиновых кислот (например, в стуле) в метагеномике - это новый поворот.[1][8] Кроме того, из-за относительного размера человеческий геном по сравнению с микробными геномами вмешательство может происходить при низких уровнях загрязнения материала.[8]

Еще одна проблема клинической метагеномики в отношении чувствительности - это диагностика коинфекции там, где присутствуют патогены с высоким титром, которые могут давать необъективные результаты, поскольку они могут непропорционально поглощать считанные данные и затруднять различение менее преобладающих патогенов.[8]

Помимо проблем с мешающими веществами, особенно в области диагностики, важны точные количественные данные и чувствительность, поскольку путаница в результатах может повлиять на третье лицо, пациента. По этой причине в настоящее время практикующим специалистам необходимо хорошо осознавать проблемы подмены индексов, связанные с Секвенирование Illumina что может привести к отслеживанию образцов с неправильным штрих-кодом.[8]

Поскольку метагеномика обычно используется для пациентов, у которых все остальные тесты до настоящего времени были отрицательными, вопросы, связанные с аналитической чувствительностью, были менее актуальны. Но для исключения причин инфекций, являющихся одной из наиболее важных ролей для клинической метагеномики, важно иметь возможность выполнять достаточно глубокое секвенирование для достижения адекватной чувствительности. Одним из способов может быть разработка новых методов подготовки библиотек.[8]

Соображения стоимости

Несмотря на то, что произошло существенное снижение затрат на создание данных о последовательностях, общая стоимость реагентов для определения последовательности пробы остается довольно высокой. Фактически, монополия Illumina на высококачественные реактивы для секвенирования нового поколения и потребность в точном и глубоком секвенировании в метагеномике означают, что одни только реактивы для секвенирования стоят больше, чем FDA -утвержденные панели синдромного тестирования. Также дополнительные прямые затраты на метагеномика такие как извлечение, подготовка библиотеки и вычислительный анализ, должны быть рассмотрены.[8]

Это приводит к общей стоимости от нескольких сотен до тысяч долларов на анализируемый образец, что выше, чем у многих других клинических тестов.[1]

В целом, метагеномное секвенирование наиболее полезно и экономично для возбудитель обнаружение при соблюдении хотя бы одного из следующих критериев:

  1. идентификации организма недостаточно (нужно выйти за рамки открытия, чтобы получить данные для геномной характеристики),
  2. а коинфекция подозревается,
  3. другие более простые методы анализа неэффективны или потребуют чрезмерно много времени,
  4. скрининг проб окружающей среды на наличие ранее неописанных или различных патогенов.[3]

Нормативные аспекты

Каждые клиническая лаборатория должны строго регулироваться, а общие лабораторные и испытательные требования должны применяться ко всем молекулярным диагностическим тестам, сообщаемым для лечения пациентов. Постоянный мониторинг особенно важен для анализов mNGS, чтобы проверить приемлемую производительность с течением времени и исследовать нетипичные результаты. Примерами важных шагов по обеспечению качества являются: начальные проверки качества образца, параметры библиотеки (концентрация и распределение по размеру), создание данных последовательности (плотность кластеров и Q-оценка), восстановление внутренних контролей и эффективность внешних контролей. Данные валидации, полученные в результате разработки и внедрения анализа, должны быть зарегистрированы и предоставлены лабораторным инспекторам или представлены в регулирующие органы, такие как FDA в США или Европейское агентство по лекарственным средствам (EMA) в Европе для получения разрешения.

Во время анализов mNGS мониторинг осуществляется с использованием образцов внутреннего контроля, внутрипробежных контрольных образцов, мазков на загрязнение и периодических проверок квалификации. Всегда необходимы дальнейшие исследования неожиданных или необычных результатов, и идентификация микроорганизмов, которые ранее не были идентифицированы в лаборатории, должна быть независимо подтверждена, обычно с помощью клинических справок или лабораторных исследований общественного здравоохранения. Кроме того, важно определить клиническое значение этих новых или атипичных организмов, и эти результаты должны быть сообщены и обсуждены с поставщиками медицинских услуг с учетом их потенциальной патогенности, а также для дальнейшего тестирования и вариантов лечения.[1]

Будущие перспективы

Технологический прогресс в методах подготовки библиотек, генерации последовательностей и вычислительной биоинформатики ведет к более быстрому и полному метагеномному анализу с меньшими затратами. В то время как текущие ограничения, такие как снижение чувствительности для возбудитель обнаружение в клинических образцах с высоким нуклеиновая кислота фон или с чрезвычайно низкими титрами патогенов, предполагают, что mNGS вряд ли заменит обычные диагностические методы в краткосрочной перспективе, возможно, это может быть дополнительным или важным тестом в определенных клинических ситуациях.[1]

Хотя использование mNGS для информирования о клинической помощи было продемонстрировано в нескольких небольших сериях случаев, почти все исследования были ретроспективными, и клиническая применимость еще не установлена ​​в крупномасштабных проспективных исследованиях. клиническое испытание. Таким образом, проспективные клинические исследования будут иметь решающее значение для понимания того, когда выполнять mNGS и как диагностический результат сравнивается с другими методами. Возможно, в течение следующих 5 лет появятся данные проспективных клинических испытаний, оценивающих клиническую полезность и экономическую эффективность mNGS, и что общие затраты и время обработки для mNGS будут продолжать снижаться.[1]

Более того, в мире, где постоянно появляются патогены, вполне вероятно, что тестирование на основе mNGS будет играть важную роль в мониторинге и отслеживании новых вспышек заболеваний. Поскольку сети наблюдения и платформы быстрой диагностики, такие как секвенирование нанопор, будут развернуты во всем мире, появится возможность обнаруживать и сдерживать вспышки инфекций на гораздо более ранней стадии, спасая жизни и снижая затраты.[1]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ а б c d е ж г час я j k л м п о п q р s т ты v ш Икс у z аа ab ac объявление ае аф аг ах ай эй Chiu, Charles Y .; Миллер, Стивен А. (июнь 2019 г.). «Клиническая метагеномика». Природа Обзоры Генетика. 20 (6): 341–355. Дои:10.1038 / s41576-019-0113-7. ISSN  1471-0064. ЧВК  6858796. PMID  30918369.
  2. ^ а б Симнер, Патриция Дж; Миллер, Стивен; Кэрролл, Карен С. (2017-10-12). «Понимание перспектив и препятствий метагеномного секвенирования следующего поколения как диагностического инструмента для инфекционных заболеваний». Клинические инфекционные болезни. 66 (5): 778–788. Дои:10.1093 / cid / cix881. ISSN  1058-4838. PMID  29040428.
  3. ^ а б c d е ж г час Малжкович Берри, Ирина; Мелендрез, Мелани К.; Бишоп-Лилли, Кимберли А; Рутвисуттинунт, Вирия; Поллетт, Саймон; Талунджич, Элдин; Мортон, Линдси; Джарман, Ричард Дж. (2019-10-14). «Методологии секвенирования и биоинформатики нового поколения для исследования инфекционных заболеваний и общественного здравоохранения: подходы, применения и соображения по развитию лабораторного потенциала». Журнал инфекционных болезней: jiz286. Дои:10.1093 / infdis / jiz286. ISSN  0022-1899. PMID  31612214.
  4. ^ Фариа, Нуно Сабино, Эстер Нуньес, Марсио Алькантара, Луис Ломан, Николас Пибус, Оливер (2016-09-29). «Мобильное наблюдение за вирусом Зика в реальном времени в Бразилии». Геномная медицина. BioMed Central Ltd. 8 (1): 97. Дои:10.1186 / s13073-016-0356-2. OCLC  963985741. ЧВК  5041528. PMID  27683027.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  5. ^ Быстрее, Джошуа; Ломан, Николас Дж .; Дюраффур, Софи; Симпсон, Джаред Т .; Севери, Этторе; Коули, Лорен; Скука, Джозеф Акой; Кундуно, Раймонд; Дудас, Гитис; Михаил, Эми; Уэдраого, Нобила (февраль 2016 г.). «Портативное секвенирование генома в режиме реального времени для эпиднадзора за Эболой». Природа. 530 (7589): 228–232. Bibcode:2016Натура.530..228Q. Дои:10.1038 / природа16996. ISSN  0028-0836. ЧВК  4817224. PMID  26840485.
  6. ^ а б c d е Уилсон, Майкл Р .; Образец, Ханна А .; Zorn, Kelsey C .; Аревало, Шон; Ю, Гиксиа; Нейгауз, Джон; Федерман, Скотт; Страйк, Дуг; Бриггс, Бенджамин; Ланжелье, Шарль; Бергер, Эми (13.06.2019). «Клиническое метагеномное секвенирование для диагностики менингита и энцефалита». Медицинский журнал Новой Англии. 380 (24): 2327–2340. Дои:10.1056 / NEJMoa1803396. ISSN  0028-4793. ЧВК  6764751. PMID  31189036.
  7. ^ а б c d е ж г Боолчандани, Маниш; D’Souza, Alaric W .; Дантас, Гаутам (июнь 2019 г.). «Методы и ресурсы на основе секвенирования для изучения устойчивости к противомикробным препаратам». Природа Обзоры Генетика. 20 (6): 356–370. Дои:10.1038 / с41576-019-0108-4. ISSN  1471-0064. ЧВК  6525649. PMID  30886350.
  8. ^ а б c d е ж г час я j k л м п Греннингер, Александр Л. (2018-07-03). «Проблема диагностической метагеномики». Экспертный обзор молекулярной диагностики. 18 (7): 605–615. Дои:10.1080/14737159.2018.1487292. ISSN  1473-7159. PMID  29898605.

внешние ссылки