Последовательность действий - Sequencing

Эта статья посвящена генетическому определению «секвенирования». О смысле «последовательности», используемом в электронной музыке, см. музыкальный секвенсор. Для последовательного обучения в когнитивной науке см. последовательное обучение. О других значениях терминов «секвенсор» и «последовательность» см. Секвенсор (значения) и Последовательность (значения).

В генетика и биохимия, последовательность действий средства для определения первичная структура (иногда неправильно называемой первичной последовательностью) неразветвленной биополимер. Последовательность приводит к символическому линейному изображению, известному как последовательность который кратко суммирует большую часть структуры атомного уровня секвенированной молекулы.

Секвенирование ДНК

Основная статья: Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК - это процесс определения нуклеотид порядок данного ДНК фрагмент. До сих пор большая часть секвенирования ДНК проводилась с использованием метод прерывания цепи разработан Фредерик Сэнгер. В этом методе используется специфичное для последовательности прекращение реакции синтеза ДНК с использованием модифицированных нуклеотидных субстратов. Однако новые технологии секвенирования, такие как пиросеквенирование завоевывают все большую долю рынка секвенирования. Пиросеквенирование дает больше данных о геноме, чем секвенирование ДНК по Сэнгеру. Пиросеквенирование позволило быстро секвенировать геном. Бактериальные геномы можно секвенировать за один прогон с многократным охватом с помощью этой техники. Этот метод также использовался для секвенирования генома Джеймс Уотсон недавно.[1]

Последовательность ДНК кодирует необходимую информацию для выживания и размножения живых существ. Таким образом, определение последовательности полезно в фундаментальных исследованиях того, почему и как живут организмы, а также в прикладных областях. Из-за ключевого значения ДНК для живых существ знание последовательностей ДНК полезно практически в любой области биологических исследований. Например, в медицине его можно использовать для выявления, диагностики и потенциальной разработки методов лечения генетических заболеваний. Точно так же исследование патогены может привести к лечению заразных заболеваний. Биотехнологии - это развивающаяся дисциплина, которая может предложить множество полезных продуктов и услуг.

Кривая Карлсона - это термин, придуманный Экономист [2] описать биотехнологический эквивалент Закон Мура, и назван в честь автора Роба Карлсона.[3] Карлсон точно предсказал, что время удвоения технологий секвенирования ДНК (измеряемое стоимостью и производительностью) будет как минимум таким же быстрым, как закон Мура.[4] Кривые Карлсона иллюстрируют быстрое (в некоторых случаях гиперэкспоненциальное) снижение стоимости и повышение производительности различных технологий, включая секвенирование ДНК, Синтез ДНК, а также ряд физических и вычислительных инструментов, используемых для экспрессии белков и определения структур белков.

Секвенирование по Сэнгеру

Основная статья: Секвенирование по Сэнгеру
Часть геля для секвенирования с радиоактивной меткой

При секвенировании терминатора цепи (секвенирование по Сэнгеру) удлинение инициируется в конкретном сайте на матричной ДНК с использованием короткого олигонуклеотидного «праймера», комплементарного матрице в этой области. Олигонуклеотидный праймер удлиняют с использованием ДНК-полимераза, фермент, который реплицирует ДНК. В состав праймера и ДНК-полимеразы входят четыре дезоксинуклеотидных основания (строительные блоки ДНК), а также низкая концентрация обрывающего цепь нуклеотида (чаще всего ди-дезоксинуклеотид). У дезоксинуклеотидов отсутствует группа ОН как в положении 2 ', так и в положении 3' молекулы рибозы, поэтому, как только они вставлены в молекулу ДНК, они предотвращают ее дальнейшее удлинение. В этом секвенаторе используются четыре разных сосуда, каждый из которых содержит только четыре дидезоксирибонуклеотида; включение нуклеотидов, обрывающих цепь, ДНК-полимеразой в случайное положение, приводит к ряду связанных фрагментов ДНК, разного размера, которые заканчиваются данным дидезоксирибонуклеотидом. Затем фрагменты разделяют по размерам с помощью электрофореза в пластинчатом полиакриламидном геле или, что чаще всего, теперь в узкой стеклянной трубке (капилляре), заполненной вязким полимером.

Просмотр начала примера чтения терминатора красителя (щелкните, чтобы развернуть)

Альтернативой мечения праймера является метка терминаторов вместо этого, что обычно называется «секвенирование терминатора с использованием красителя». Основным преимуществом этого подхода является то, что полный набор секвенирования может быть выполнен за одну реакцию, а не за четыре, необходимые для подхода с использованием меченых праймеров. Это достигается путем мечения каждого из терминаторов дидезоксинуклеотидной цепи отдельным флуоресцентным красителем, который флуоресцирует на разных участках. длина волны. Этот метод проще и быстрее, чем подход с праймером для красителя, но он может давать более неравномерные пики данных (разную высоту) из-за разницы, зависящей от матрицы, во включении крупных обрывателей цепи красителя. Эта проблема была значительно уменьшена с введением новых ферментов и красителей, которые минимизируют вариабельность включения. Этот метод теперь используется для подавляющего большинства реакций секвенирования, поскольку он проще и дешевле. Основная причина этого заключается в том, что праймеры не нужно маркировать отдельно (что может быть значительным расходом для одноразового индивидуального праймера), хотя это не так важно для часто используемых «универсальных» праймеров. Ситуация быстро меняется из-за повышения экономической эффективности систем второго и третьего поколения от Illumina, 454, ABI, Helicos и Dover.

Пиросеквенирование

Метод пиросеквенирования основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотидов. Перед проведением пиросеквенирования последовательность ДНК должна быть амплифицирована с помощью ПЦР. Затем выбирается порядок, в котором нуклеотиды должны быть добавлены в секвенсор (т. Е. G-A-T-C). Когда добавляется конкретный нуклеотид, если ДНК-полимераза включает его в растущую цепь, пирофосфат высвобождается и превращается в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы. АТФ способствует окислению люциферазы через люциферазу; эта реакция генерирует световой сигнал, записанный в виде пика пирограммы. Таким образом, включение нуклеотидов коррелирует с сигналом. Световой сигнал пропорционален количеству нуклеотидов, включенных во время синтеза цепи ДНК (т. Е. Два включенных нуклеотида соответствуют двум пикам пирограммы). Когда добавленные нуклеотиды не включены в молекулу ДНК, сигнал не записывается; фермент апираза удаляет все не включенные нуклеотиды, оставшиеся в реакции. Этот метод не требует ни флуоресцентно меченных нуклеотидов, ни гель-электрофореза.Пиросеквенирование, который был разработан Полом Ниреном и Мостафой Ронаги ДНК, был коммерциализирован Biotage (для секвенирования с низкой пропускной способностью) и 454 Life Sciences (для секвенирования с высокой пропускной способностью). Последние платформенные последовательности примерно 100 мегабазы [теперь до 400 мегабаз] за семь часов работы с одной машиной. В методе на основе массивов (коммерциализированном 454 Life Sciences) одноцепочечная ДНК отжигается до гранул и амплифицируется с помощью EmPCR. Эти связанные с ДНК шарики затем помещаются в lls на волоконно-оптическом чипе вместе с ферменты которые производят свет в присутствии АТФ. Когда свободные нуклеотиды промывают этот чип, свет вырабатывается, поскольку АТФ генерируется, когда нуклеотиды соединяются со своими комплементарными пар оснований. Добавление одного (или нескольких) нуклеотидов приводит к реакции, которая генерирует световой сигнал, который записывается камерой CCD в приборе. Сила сигнала пропорциональна количеству нуклеотидов, например гомополимерных участков, включенных в единый поток нуклеотидов. [1]

Истинное секвенирование одной молекулы

Крупномасштабное секвенирование

В то время как вышеупомянутые методы описывают различные методы секвенирования, отдельные родственные термины используются, когда секвенируется большая часть генома. Было разработано несколько платформ для выполнения секвенирование экзома (подмножество всей ДНК по всем хромосомам, кодирующим гены) или полногеномное секвенирование (секвенирование всей ядерной ДНК человека).

Секвенирование РНК

РНК менее стабилен в клетке, а также более подвержен нуклеазной атаке экспериментально. Поскольку РНК генерируется транскрипция информация из ДНК уже присутствует в ДНК клетки. Однако иногда желательно последовательность РНК молекулы. В то время как секвенирование ДНК дает генетический профиль организма, секвенирование РНК отражает только те последовательности, которые активно используются. выразил в камерах. Обычный метод секвенирования РНК - это сначала обратная расшифровка РНК извлекают из образца для создания фрагментов кДНК. Затем это можно секвенировать, как описано выше. Основная часть РНК, экспрессируемой в клетках, рибосомные РНК или же малые РНК, вредно для клеточной трансляции, но часто не является предметом исследования. Эта фракция может быть удалена in vitroоднако, чтобы обогатить также включенную информационную РНК, которая обычно является представляет интерес. Получено из экзоны эти мРНК должны быть позже переведено к белки которые поддерживают определенные клеточные функции. В профиль выражения поэтому указывает на клеточную активность, особенно желательную при изучении заболеваний, клеточного поведения, ответов на реагенты или раздражители. Эукариотический Молекулы РНК не обязательно коллинеарный с их шаблоном ДНК, как интроны вырезаются. Это создает определенную сложность для сопоставления считываемых последовательностей с геномом и, таким образом, для определения их происхождения. Для получения дополнительной информации о возможностях секвенирования следующего поколения применительно ко всему транскриптомы видеть: РНК-Seq и Секвенирование микроРНК.

Секвенирование белков

Основная статья: секвенирование белков

Способы выполнения белок секвенирование включает:

Если ген, кодирующий белок, известен, в настоящее время намного проще секвенировать ДНК и вывести последовательность белка. Определение части белка аминокислота последовательность (часто один конец) одним из вышеуказанных методов может быть достаточной для идентификации клон несущий этот ген.

Секвенирование полисахаридов

Хотя полисахариды также являются биополимерами, говорить о «секвенировании» полисахарида не так уж часто по нескольким причинам. Хотя многие полисахариды линейны, у многих есть ответвления. Множество разных юнитов (отдельные моносахариды ) можно использовать, и связанный по-разному. Однако основная теоретическая причина заключается в том, что в то время как другие полимеры, перечисленные здесь, в основном генерируются «матрично-зависимым» образом одним обрабатывающим ферментом, каждое отдельное соединение в полисахариде может быть образовано разными фермент. Во многих случаях сборка не указывается однозначно; в зависимости от того, какой фермент действует, может быть включена одна из нескольких различных единиц. Это может привести к образованию семейства подобных молекул. Это особенно верно для полисахаридов растений. Методы для определение структуры из олигосахариды и полисахариды включают ЯМР спектроскопия и анализ метилирования.[5]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Уиллер, Дэвид А .; Шринивасан, Майтрейан; Эгхольм, Майкл; Шен, Юфэн; Чен, Лэй; Макгуайр, Эми; Он, Вен; Чен И-Цзюй; Махиджани, Винод (17 апреля 2008 г.). «Полный геном человека путем массового параллельного секвенирования ДНК». Природа. 452 (7189): 872–876. Bibcode:2008Натура 452..872Вт. Дои:10.1038 / природа06884. ISSN  0028-0836. PMID  18421352.
  2. ^ Жизнь 2.0. (2006, 31 августа). Экономист
  3. ^ Карлсон, Роберт Х. Биология - это технология: перспективы, опасность и новый бизнес инженерной жизни. Кембридж, Массачусетс: Гарвардский университет, 2010. Печать
  4. ^ Карлсон, Роберт (2003). «Темпы и распространение биологических технологий». Биозащита и биотерроризм: стратегия, практика и наука биозащиты. 1 (3): 203–214. Дои:10.1089/153871303769201851. PMID  15040198.
  5. ^ Практическое руководство по структурному анализу углеводов