Снятие пептидных масс - Peptide mass fingerprinting

Типичный рабочий процесс эксперимента по массовому снятию пептидных отпечатков пальцев.

Снятие пептидных масс (PMF) (также известный как белковые отпечатки пальцев) является аналитическим методом для белок идентификация, при которой интересующий неизвестный белок сначала расщепляется на более мелкие пептиды, абсолютные массы которых можно точно измерить с помощью масс-спектрометр Такие как МАЛДИ-ТОФ или же ESI-TOF.[1] Метод был разработан в 1993 году несколькими группами самостоятельно.[2][3][4][5][6] Массы пептидов сравнивают либо с базой данных, содержащей известные белковые последовательности, либо даже с геномом. Это достигается с помощью компьютерных программ, которые переводят известный геном организма в белки, затем теоретически разрезают белки на пептиды и вычисляют абсолютные массы пептидов из каждого белка. Затем они сравнивают массы пептидов неизвестного белка с теоретическими массами пептидов каждого белка, кодируемого в геноме. Результаты статистически анализируются, чтобы найти наилучшее соответствие.

Преимущество этого метода заключается в том, что необходимо знать только массы пептидов. Кропотливый de novo пептидное секвенирование тогда не нужно. Недостатком является то, что последовательность белка должна присутствовать в интересующей базе данных. Кроме того, большинство алгоритмов PMF предполагают, что пептиды происходят из одного белка.[7] Присутствие смеси может значительно усложнить анализ и потенциально поставить под угрозу результаты. Типичным для идентификации белка на основе PMF является требование для изолированного белка. Смеси, содержащие более 2-3 белков, обычно требуют дополнительного использования МС / МС на основе идентификации белков для достижения достаточной специфичности идентификации (6). Следовательно, типичные образцы PMF представляют собой изолированные белки из двумерный гель-электрофорез (2D гели) или изолированные SDS-СТРАНИЦА группы. Дополнительные анализы МС / МС может быть либо прямым, например, MALDI-TOF / TOF-анализ, либо последующий нано-ЖК-ESI-MS / MS анализ элюатов гелевых пятен.[7][8]

Происхождение

Из-за долгого и утомительного процесса анализа белков был разработан массовый фингерпринт пептидов. Эдман деградация использовался при анализе белков, и на анализ одного аминокислотного остатка требовался почти час.[9] SDS-СТРАНИЦА также использовался для разделения белков в очень сложных смесях, в которых также использовались методы электроблоттинга и окрашивания.[10] Затем полосы будут извлечены из геля и секвенированы автоматически. Повторяющейся проблемой в этом процессе было то, что мешающие белки также очищались с помощью интересующего белка. Последовательности этих интерферирующих белков были скомпилированы в так называемую базу данных Dayhoff.[11] В конечном итоге наличие последовательностей этих известных белковых примесей в базах данных сократило время работы прибора и расходы, связанные с анализом белков.

Базовые приготовления

Образцы белка могут быть получены из SDS-СТРАНИЦА[7] или же обращенно-фазовая ВЭЖХ, а затем подвергаются некоторым химическим модификациям. Дисульфидные мостики в белках восстанавливаются, а аминокислоты цистеина химически карбамидометилируются или акриламидируются во время гель-электрофореза.

Затем белки разрезают на несколько фрагментов с помощью протеолитических ферментов, таких как трипсин, химотрипсин или же Glu-C. Типичный образец: протеаза соотношение составляет 50: 1. Протеолиз обычно проводят в течение ночи, и полученные пептиды экстрагируют ацетонитрил и сушили под вакуумом. Затем пептиды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды или дополнительно концентрируют и очищают, и их можно использовать для масс-спектрометрического анализа.

Масс-спектрометрический анализ

Расщепленный белок можно анализировать с помощью различных типов масс-спектрометров, таких как ESI-TOF или МАЛДИ-ТОФ. MALDI-TOF часто является предпочтительным инструментом, потому что он позволяет использовать большой объем образца и несколько белков могут быть проанализированы в одном эксперименте, если дополнить его МС / МС анализ. LC / ESI-MS и CE / ESI-MS также являются отличными методами для снятия отпечатков пептидных масс.[12][13]

Небольшая часть пептида (обычно 1 микролитр или меньше) пипетированный на мишень MALDI и химическое вещество, называемое матрица добавляется к пептидной смеси. Общие матрицы Синапиновая кислота, Альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота, и 2,3-дигидроксибензойная кислота. Молекулы матрицы необходимы для десорбция молекул пептида. Молекулы матрицы и пептида совместно кристаллизуются на мишени MALDI и готовы к анализу. Существует один метод подготовки образцов, в котором используется преимущественно MALDI-MS, а именно метод высушенных капель.[14] Мишень вставляется в вакуумную камеру масс-спектрометра, и десорбция и ионизация полипептидных фрагментов инициируются импульсным лазерным лучом, который передает большое количество энергии молекулам матрицы. Переноса энергии достаточно, чтобы способствовать ионизации и переходу молекул матрицы и пептидов из твердой фазы в газовую фазу. Ионы ускоряются в электрическом поле масс-спектрометра и летят к детектору ионов, где их прибытие регистрируется как электрический сигнал. Их отношение массы к заряду пропорционально их массе. время полета (TOF) в дрейфовой трубке и может быть рассчитан соответствующим образом.

Связывание ESI с капиллярной LC позволяет отделить пептиды от перевариваемых белков, одновременно получая их молекулярные массы.[15] Капиллярный электрофорез в сочетании с ESI-MS - еще один метод; однако лучше всего он работает при анализе небольших количеств белков.[13]

Вычислительный анализ

Масс-спектрометрический анализ дает список молекулярных масс фрагментов, который часто называют списком пиков. Массы пептидов сравнивают с базами данных белков, такими как Swissprot, которые содержат информацию о последовательности белков. Программное обеспечение выполняет in silico переваривает белки из базы данных тем же ферментом (например, трипсином), который используется в реакции химического расщепления. Затем рассчитывают массу этих пептидных фрагментов и сравнивают со списком пиков измеренных масс пептидов. Результаты статистически анализируются, и возможные совпадения возвращаются в таблице результатов.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Клаузер KR, Бейкер P, Burlingame AL (1999). «Роль точного измерения массы (+/- 10 ppm) в стратегиях идентификации белков с использованием МС или МС / МС и поиска в базе данных». Анальный. Chem. 71 (14): 2871–82. Дои:10.1021 / ac9810516. PMID  10424174.
  2. ^ Паппин DJ, Хойруп П., Близби А.Дж. (1993). «Быстрая идентификация белков путем снятия отпечатков пальцев по массе пептидов». Curr. Биол. 3 (6): 327–32. Дои:10.1016 / 0960-9822 (93) 90195-Т. PMID  15335725.
  3. ^ Хензель В.Дж., Биллеци Т.М., Стултс Д.Т., Вонг С.К., Гримли С., Ватанабе С. (1993). «Идентификация белков из двумерных гелей путем молекулярно-массового поиска пептидных фрагментов в базах данных последовательностей белков». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 90 (11): 5011–5. Bibcode:1993PNAS ... 90.5011H. Дои:10.1073 / пнас.90.11.5011. ЧВК  46643. PMID  8506346.
  4. ^ Манн М., Хойруп П., Рёпсторфф П. (1993). «Использование масс-спектрометрической информации о молекулярной массе для идентификации белков в базах данных последовательностей». Биологическая масс-спектрометрия. 22 (6): 338–45. Дои:10.1002 / bms.1200220605. PMID  8329463.
  5. ^ Джеймс П., Квадрони М., Карафоли Е., Гонне Г. (1993). «Идентификация белков по отпечаткам пальцев массового профиля». Biochem. Биофиз. Res. Сообщество. 195 (1): 58–64. Дои:10.1006 / bbrc.1993.2009. PMID  8363627.
  6. ^ Йетс-младший, Спайчер С., Гриффин П.Р., Хункапиллер Т. (1993). «Массовые карты пептидов: высокоинформативный подход к идентификации белков». Анальный. Биохим. 214 (2): 397–408. Дои:10.1006 / abio.1993.1514. PMID  8109726.
  7. ^ а б c Шевченко А., Йенсен О.Н., Подтелейников А.В., Саглиокко Ф., Вильм М., Ворм О, Мортенсен П., Шевченко А., Бушери Х, Манн М. (1996). «Связывание генома и протеома с помощью масс-спектрометрии: широкомасштабная идентификация дрожжевых белков из двумерных гелей». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 93 (25): 14440–5. Bibcode:1996PNAS ... 9314440S. Дои:10.1073 / пнас.93.25.14440. ЧВК  26151. PMID  8962070.
  8. ^ Ван В., Сунь Дж., Нимц М., Деквер В. Д., Цзэн А. П. (2003). «Идентификация белков на основе анализа двумерного гель-электрофореза Klebsiella pneumoniae путем комбинированного использования данных масс-спектрометрии и исходных последовательностей генома». Протеомная наука. 1 (1): 6. Дои:10.1186/1477-5956-1-6. ЧВК  317362. PMID  14653859.
  9. ^ Хензель, Уильям Дж .; Ватанабэ, Колин; Стултс, Джон Т. (01.09.2003). «Идентификация белков: происхождение фингерпринта пептидных масс». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 14 (9): 931–942. Дои:10.1016 / S1044-0305 (03) 00214-9. ISSN  1044-0305. PMID  12954162.
  10. ^ Мацудаира, П. (1987-07-25). «Последовательность пикомольных количеств белков, нанесенных электроблоттингом на поливинилидендифторидные мембраны». Журнал биологической химии. 262 (21): 10035–10038. ISSN  0021-9258. PMID  3611052.
  11. ^ B C Orcutt; D G George; Дэйхофф и М. О. (1983). "Системы баз данных последовательностей белков и нуклеиновых кислот". Ежегодный обзор биофизики и биоинженерии. 12 (1): 419–441. Дои:10.1146 / annurev.bb.12.060183.002223. PMID  6347043.
  12. ^ Moore, R.E .; Licklider, L .; Schumann, D .; Ли, Т. Д. (1998-12-01). «Микромасштабный интерфейс электроспрея, включающий монолитную подложку из поли (стирол-дивинилбензол) для жидкостной хроматографии / тандемного масс-спектрометрического анализа пептидов и белков». Аналитическая химия. 70 (23): 4879–4884. Дои:10.1021 / ac980723p. ISSN  0003-2700. PMID  9852776.
  13. ^ а б Уитмор, Колин Д .; Дженнаро, Линн А. (01.06.2012). «Методы капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии для триптического пептидного картирования терапевтических антител». Электрофорез. 33 (11): 1550–1556. Дои:10.1002 / elps.201200066. ISSN  1522-2683. PMID  22736356.
  14. ^ Тиде, Бернд (2005). «Массовая дактилоскопия пептидов». Методы. 35 (3): 237–247. Дои:10.1016 / j.ymeth.2004.08.015. PMID  15722220.
  15. ^ Дасс, Чхабил (2007). Основы современной масс-спектрометрии | Интернет-книги Wiley. Дои:10.1002/0470118490. ISBN  9780470118498.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Снятие пептидных масс