Вертико-пространственно модулированное освещение - Vertico spatially modulated illumination

Двухцветная 3D микроскопия со сверхвысоким разрешением с Her2 и Her3 в клетках рака груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM + SMI

Вертико-пространственно модулированное освещение (Вертико-СМИ) самый быстрый[нужна цитата ] оптический микроскоп для трехмерного анализа полных ячеек в нанометр классифицировать. Он основан на двух технологиях, разработанных в 1996 году, SMI (пространственно-модулированное освещение) и SPDM (спектральная точная дистанционная микроскопия). Эффективное оптическое разрешение этого оптического наноскопа достигло примерно 5 нм в 2D и 40 нм в 3D, что значительно превосходит предел разрешения λ / 2 (около 200 нм для синего света), применяемый в стандартной микроскопии с использованием пропускания или отражения естественного света. (в отличие от структурированное освещение или же флуоресценция ) согласно Предел разрешения Аббе[1] Этот предел (также известный как Предел Рэлея ) был определен Эрнст Аббе в 1873 г. и определяет предел достижимого разрешения микроскопов с использованием обычных методов.

Микроскоп Vertico-SMI был разработан командой во главе с Кристоф Кремер, заслуженный[2] в Гейдельбергский университет, и основан на сочетании светооптических методов локализационной микроскопии (SPDM, спектральная прецизионная дистанционная микроскопия) и структурированное освещение (СМИ, пространственно модулированное освещение).

С марта 2008 года многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP и Алекса флуоресцентный красители могут использоваться с этой так называемой SPDMphymod (физически изменяемыми флуорофорами) микроскопией локализации, для которой достаточно только одной длины волны лазера подходящей интенсивности для наноизображения.

Конфигурация

SMI - это особый тип лазерной оптической подсветки (пространственно модулированное освещение) и Vertico отражает вертикальное расположение оси микроскопа, что делает возможным анализ неподвижных клетки но также и живых клеток с оптическим разрешением ниже 10 нанометров (1 нанометр = 1 нм = 1 × 10−9 м).

Особенность этой технологии по сравнению с такими методами фокусировки, как 4Pi микроскопия, представляет собой экспозицию в широком поле, позволяющую изобразить целые клетки в наномасштабе. Такое 3D-экспонирование целой клетки с типичным размером объекта 20 мкм × 20 мкм требует всего 2 минут. Экспозиции с широким полем означают, что весь объект освещается и обнаруживается одновременно.

Пространственно модулированное освещение

СМИ + TIRF ткани глаза человека, пораженной дегенерация желтого пятна

SMI-микроскопия - это светооптический процесс так называемого функция разброса точки -инжиниринг. Это процессы, которые изменяют функцию рассеяния точки (PSF) микроскоп подходящим образом для увеличения оптического разрешения, чтобы максимизировать точность расстояние измерения флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длина волны освещающего света или для извлечения других структурных параметров в нанометровом диапазоне.

Микроскоп SMI, разрабатываемый в Физическом институте Кирхгофа при Гейдельбергском университете, достигает этого следующим образом: интенсивность освещения в пределах диапазона объектов неоднородна, в отличие от обычных широкопольных флуоресцентных микроскопов, но пространственно модулируется точным образом за счет использования двух противоположных мешающих лазерных лучей вдоль оси. Принцип пространственно-модулированного волнового поля был разработан в 1993 году Бейли и др. Подход микроскопии SMI, используемый в приложении Heidelberg, перемещает объект с высокой точностью шагами через волновое поле, или само волновое поле перемещается относительно объекта за счет фазового сдвига. Это приводит к улучшенному осевому размеру и разрешающей способности по расстоянию.[3][4]

SMI можно комбинировать с другими технологиями сверхвысокого разрешения, например, с 3D LIMON или LSI-TIRF как полное внутреннее отражение интерферометр с боковой подсветкой. Этот метод SMI позволил получить светооптические изображения распределения автофлуорофоров в срезах ткани глаза человека с непревзойденным ранее оптическим разрешением. Использование трех различных длин волн возбуждения (488, 568 и 647 нм) позволяет собирать спектральную информацию о сигнале автофлуоресценции. Это было использовано для тканей глаза человека, пораженных дегенерация желтого пятна AMD.[5]

SPDM: микроскопия локализации

Микроскопия одиночной молекулы YFP с высоким разрешением / SPDMphymod

Одиночный крошечный источник света может быть обнаружен намного лучше, чем разрешение микроскопа: хотя свет будет давать размытое пятно, можно использовать компьютерные алгоритмы для точного расчета центр размытого пятна с учетом функция разброса точки микроскопа, шумовых свойств детектора и т. д. Однако этот подход не работает, когда слишком много источников близко друг к другу: все источники размываются вместе.

SPDM (спектральная дистанционная микроскопия) - это семейство методов в флуоресцентная микроскопия который позволяет обойти эту проблему, измеряя всего несколько источников одновременно, так что каждый источник «оптически изолирован» от других (т.е. разделен на разрешение больше, чем разрешение микроскопа, обычно ~ 200-250 нм).[6][7][8] Затем можно использовать описанную выше технику (нахождение центра каждого размытого пятна).

Если молекулы имеют множество различных спектров (спектры поглощения и / или спектры излучения), то можно наблюдать за светом всего нескольких молекул одновременно, используя соответствующие источники света и фильтры. Молекулы также можно различать более тонкими способами на основе флуоресцентное время жизни и другие техники.[6]

Структурное разрешение, достижимое с помощью SPDM, может быть выражено через наименьшее измеряемое расстояние между двумя в их пространственном положении определенными точечными частицами с разными спектральными характеристиками («топологическое разрешение»). Моделирование показало, что при подходящих условиях, касающихся точности локализации, плотности частиц и т. Д., «Топологическое разрешение» соответствует «космическая частота "что в терминах классического определения эквивалентно значительно улучшенному оптическому разрешению.

SPDM - это локализационная микроскопия, которая обеспечивает эффективное оптическое разрешение в несколько раз лучше, чем обычное оптическое разрешение (приблизительно 200–250 нм), представленное полушириной основного максимума функции эффективного точечного изображения. Применяя подходящие лазерные оптические прецизионные процессы, положение и расстояния, значительно меньшие, чем полуширина функции рассеяния точки (обычно 200–250 нм), могут быть измерены с нанометровой точностью между целями с разными спектральными характеристиками.[6] Важная область применения - исследование генома (изучение функциональной организации геном ). Еще одна важная область применения - это исследование структуры мембран.

Одной из важнейших основ локализационной микроскопии в целом является первая экспериментальная работа по локализации флуоресцентных объектов в наномасштабе (3D) в 1996 году. [9] и теоретические и экспериментальные доказательства точности локализации с использованием видимого света в диапазоне 1 нм - основа для микроскопии локализации лучше, чем 1/100 длины волны.[10][11]

SPDMphymod: стандартные флуоресцентные красители в мигающем режиме типа GFP

Двухцветная локализационная микроскопия SPDMфимод / микроскопия сверхвысокого разрешения с использованием гибридных белков GFP и RFP

Только в последние два года в наноскопических исследованиях использовались молекулы, которые излучают одну и ту же спектральную частоту света (но с разными спектральными характеристиками, основанными на характеристиках мигания), но которые можно включать и выключать с помощью света, что необходимо для спектральной точности. дистанционная микроскопия. Комбинируя многие тысячи изображений одной и той же клетки, стало возможным использовать лазерные оптические прецизионные измерения для записи изображений локализации со значительно улучшенным оптическим разрешением. Применение этих новых процессов наноскопии до недавнего времени представлялось очень сложным, поскольку предполагалось, что только специально изготовленные молекулы можно включать и выключать подходящим образом с помощью света.

В марте 2008 г. Кристоф Кремер Лаборатория обнаружила, что это также возможно для многих стандартных флуоресцентных красителей, таких как GFP, Красители Alexa и молекулы флуоресцеина при соблюдении определенных фотофизических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для создания наноизображений достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. В отличие от других локализационных микроскопов, когда используются специальные фотопереключаемые / фотоактивируемые флуоресцентные молекулы, для которых необходимы две длины волны лазера.[12]

Ген GFP был введен и экспрессирован во многих прокариотических и эукариотических клетках, а также Нобелевская премия в Химия 2008 был награжден Мартин Чалфи, Осаму Шимомура, и Роджер Ю. Цзянь за открытие и разработку зеленого флуоресцентного белка. Открытие возможности использования этих стандартных флуоресцентных молекул расширяет применимость метода SPMD к многочисленным областям исследований в биофизика, клеточная биология и лекарство.

Стандартные флуоресцентные красители, уже успешно используемые с технологией SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 и флуоресцеин.

LIMON: 3D микроскопия сверхвысокого разрешения

LIMON (Light MicrOscopical nanosize microscopy) был изобретен в 2001 году в Гейдельбергском университете и сочетает в себе локализационную микроскопию и пространственно-модулированное освещение с трехмерной микроскопией сверхвысокого разрешения.

Трехмерные изображения с использованием Vertico-SMI становятся возможными благодаря комбинации SMI и SPDM, при этом сначала применяется SMI, а затем процесс SPDM. Процесс SMI определяет центр частиц и их распространение в направлении оси микроскопа. Хотя центр частиц / молекул может быть определен с точностью 1-2 нм, разброс вокруг этой точки можно определить вплоть до осевого диаметра прибл. 30-40 нм.

Впоследствии боковой положение отдельных частиц / молекул определяется с помощью SPDM с точностью до нескольких нанометров. В настоящее время SPDM достигает 16 кадров / сек с эффективным разрешением 10 нм в 2D (объектная плоскость); приблизительно 2000 таких кадров комбинируются с данными SMI (время сбора данных около 10 секунд) для получения трехмерного изображения с наивысшим разрешением (эффективное оптическое разрешение 3D составляет около 40-50 нм). С более быстрым камера, можно ожидать еще более высоких скоростей (до нескольких сотен кадров в секунду, в разработке). Используя подходящие красители, можно добиться еще более высокого эффективного оптического 3D разрешения.[13]

Комбинируя SPDMphymod с SMI (оба из которых были изобретены в лаборатории Кристофа Кремера в 1996 году) была достигнута трехмерная двухцветная реконструкция пространственного расположения кластеров Her2 / neu и Her3. Положения во всех трех направлениях кластеров белка можно было определить с точностью около 25 нм.[14]

Использование микроскопии сверхвысокого разрешения в промышленности

Несмотря на то, что технологии сверхвысокого разрешения используются в биомедицинских лабораториях, они могут служить важным инструментом в фармацевтических исследованиях. Они могут быть особенно полезны при идентификации и оценке целей. Например, биомолекулярные машины (БММ) представляют собой очень сложные наноструктуры, состоящие из нескольких больших молекул и отвечающие за основные функции в клетках организма. В зависимости от своего функционального статуса они имеют определенную трехмерную структуру. Примерами биомолекулярных машин являются нуклеосомы, которые позволяют ДНК, носителю генетической информации длиной два метра, складываться в клетках тела всего лишь на площади в несколько миллионных миллиметра в диаметре. Следовательно, ДНК может служить центром информации и управления.

Используя LIMON 3D в сочетании с комплексной маркировкой LIMON, можно впервые сделать видимыми скрытые белки или нуклеиновые кислоты 3D-молекулярного комплекса так называемых биомолекулярных машин без разрушения комплекса. До сих пор проблема в большинстве случаев заключалась в том, что комплекс необходимо было разрушить для детального анализа отдельных макромолекул в нем. В качестве альтернативы, для визуализации трехмерной структуры таких комплексов использовались виртуальные компьютерные имитационные модели или дорогостоящие методы ядерного магнитного резонанса.[15]

Литература

  1. ^ Рейманн, Дж; Баддели, Д.; Гункель, М; Lemmer, P; Стадтер, Вт; Jegou, T; Риппе, К; Cremer, C; Бирк, У (2008). «Высокоточный структурный анализ субядерных комплексов в фиксированных и живых клетках с помощью микроскопии с пространственно-модулированным освещением (SMI)». Хромосомные исследования. 16 (3): 367–82. Дои:10.1007 / s10577-008-1238-2. PMID  18461478.
  2. ^ "Fakultät für Physik und Astronomie".
  3. ^ Хайнцманн Р., Кремер К. (1999). «Микроскопия с боковым модулированным возбуждением: Улучшение разрешения за счет дифракционной решетки". Proc. SPIE. 3568: 185–196. Bibcode:1999SPIE.3568..185H. Дои:10.1117/12.336833. S2CID  128763403.
  4. ^ Патент США 7 342 717: Кристоф Кремер, Майкл Хаусманн, Иоахим Брадл, Бернхард Шнайдер Микроскоп волнового поля с функцией распределения точки обнаружения, дата приоритета 10 июля 1997 г.
  5. ^ Best G, Amberger R, Baddeley D, Ach T, Dithmar S, Heintzmann R, Cremer C (2011). «Структурированная световая микроскопия автофлуоресцентных скоплений в тканях человека». Микрон. 42 (4): 330–335. Дои:10.1016 / j.micron.2010.06.016. PMID  20926302.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  6. ^ а б c Леммер П., Гункель М., Баддели Д., Кауфманн Р., Урих А., Вейланд Ю., Рейманн Дж., Мюллер П., Хаусманн М., Кремер С. (2008). "SPDM: световая микроскопия с разрешением отдельных молекул в наномасштабе" (PDF). Прикладная физика B. 93 (1): 1–12. Bibcode:2008АпФБ..93 .... 1л. Дои:10.1007 / s00340-008-3152-x. S2CID  13805053.CS1 maint: использует параметр авторов (связь)
  7. ^ ЯВЛЯЮСЬ. ван Ойен, Дж. Кёлер, Дж. Шмидт, М. Мюллер, Г. Дж. Бракенхофф (31 июля 1998 г.). «Трехмерное сверхвысокое разрешение за счет спектрально-селективной визуализации» (PDF). Письма по химической физике. 292 (1–2): 183–187. Bibcode:1998CPL ... 292..183В. Дои:10.1016 / S0009-2614 (98) 00673-3.CS1 maint: использует параметр авторов (связь)
  8. ^ Борнфлет, Зетцлер, Эйлс, Кремер (1 февраля 1998 г.). «Высокоточные измерения расстояний и сегментация объектов с сохранением объема вблизи и ниже предела разрешения в трехмерной конфокальной флуоресцентной микроскопии». Журнал микроскопии. 189 (2): 118–136. Дои:10.1046 / j.1365-2818.1998.00276.x. S2CID  73578516.CS1 maint: использует параметр авторов (связь)
  9. ^ Брэдл Дж., Ринке Б., Эса А., Эдельманн П., Кригер Х., Шнайдер Б., Хаусманн М., Кремер К. (1996). Бигио, Ирвинг Дж; Grundfest, Warren S; Шнекенбургер, Герберт; Сванберг, Катарина; Viallet, Pierre M (ред.). «Сравнительное исследование точности трехмерной локализации в традиционной, конфокальной лазерной сканирующей и аксиалтомографической флуоресцентной световой микроскопии». Proc. SPIE. Оптическая биопсия и микроскопические методы. 2926: 201–206. Bibcode:1996SPIE.2926..201B. Дои:10.1117/12.260797. S2CID  55468495.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  10. ^ Хайнцманн Р., Мюнх Х., Кремер К. (1997). «Высокоточные измерения в эпифлуоресцентной микроскопии - моделирование и эксперимент». Cell Vision. 4: 252–253.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  11. ^ Патент США 6,424,421: Кристоф Кремер, Майкл Хаусманн, Иоахим Брадл, Бернд Ринке Способ и устройства для измерения расстояний между конструкциями объекта, дата приоритета 23 декабря 1996 г.
  12. ^ Мануэль Гункель, Фабиан Эрдель, Карстен Риппе, Пауль Леммер, Райнер Кауфманн, Кристоф Хёрманн, Роман Амбергер и Кристоф Кремер (2009): Двухцветная локализационная микроскопия клеточных наноструктур. В: Журнал биотехнологии, 2009, 4, 927-938. ISSN  1860-6768
  13. ^ Баддели Д., Батрам К., Вейланд И., Кремер С., Бирк Ю.: Анализ наноструктуры с использованием микроскопии с пространственно-модулированным освещением. В: Протоколы природы 2007; 2: 2640–2646
  14. ^ Кауфманн Райнер, Мюллер Патрик, Хильденбранд Георг, Хаусманн Михаэль, Кремер Кристоф (2010). «Анализ кластеров мембранного белка Her2 / neu в различных типах клеток рака груди с использованием микроскопии локализации». Журнал микроскопии. 242 (1): 46–54. Дои:10.1111 / j.1365-2818.2010.03436.x. PMID  21118230. S2CID  2119158.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  15. ^ Микроскопия сверхвысокого разрешения для фармацевтической промышленности: выданы патенты на комплексную трехмерную маркировку В архиве 9 января 2012 г. Wayback Machine

внешняя ссылка