Оптический микроскоп - Optical microscope

Современный оптический микроскоп с ртутная лампа за флуоресцентная микроскопия. Микроскоп имеет цифровая камера который подключен к компьютер.

В оптический микроскоп, также называемый оптический микроскоп, это тип микроскоп который обычно использует видимый свет и система линзы для создания увеличенных изображений мелких объектов. Оптические микроскопы - это старейшая конструкция микроскопов, которая, возможно, была изобретена в нынешней сложной форме в 17 веке. Базовые оптические микроскопы могут быть очень простыми, хотя многие сложные конструкции направлены на улучшение разрешающая способность и образец контраст.

Объект размещен на сцена и может просматриваться через один или два окуляры на микроскопе. В микроскопах с большим увеличением оба окуляра обычно показывают одно и то же изображение, но с стерео микроскоп, используются несколько иные изображения для создания трехмерного эффекта. Для захвата изображения обычно используется камера (микрофотография ).

Образец можно зажечь разными способами. Прозрачные объекты можно освещать снизу, а твердые объекты можно освещать светом, проходящим через них (светлое поле ) или около (темное поле ) линза объектива. Поляризованный свет может использоваться для определения кристаллической ориентации металлических объектов. Фазово-контрастное изображение может использоваться для увеличения контрастности изображения путем выделения мелких деталей с различным показателем преломления.

Диапазон цель Объективы с разным увеличением обычно устанавливаются на турели, что позволяет им поворачивать на место и дает возможность увеличивать масштаб. Максимальное увеличение оптических микроскопов обычно ограничивается примерно 1000x из-за ограниченной разрешающей способности видимого света. Увеличение составного оптического микроскопа является произведением увеличения окуляра (скажем, 10x) и линзы объектива (скажем, 100x), что дает общее увеличение в 1000 раз. Измененная среда, такая как использование масла или ультрафиолетового света, может увеличить увеличение.

Альтернативы оптической микроскопии, не использующие видимый свет, включают: сканирующая электронная микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия и сканирующая зондовая микроскопия и, как следствие, можно добиться гораздо большего увеличения.

Типы

Схема простого микроскопа

Есть два основных типа оптических микроскопов: простые микроскопы и составные микроскопы. В простом микроскопе используется оптическая сила одной линзы или группы линз для увеличения. В составном микроскопе используется система линз (один набор увеличивает изображение, создаваемое другим) для достижения гораздо большего увеличения объекта. Подавляющее большинство современных исследование микроскопы - сложные микроскопы, в то время как некоторые более дешевые коммерческие цифровые микроскопы представляют собой простые однолинзовые микроскопы. Составные микроскопы можно далее разделить на множество других типов микроскопов, которые различаются своей оптической конфигурацией, стоимостью и назначением.

Простой микроскоп

В простом микроскопе используется линза или набор линз, чтобы увеличить объект только за счет углового увеличения, давая зрителю прямое увеличенное изображение. виртуальное изображение.[1][2] Использование одной выпуклой линзы или групп линз можно найти в простых устройствах увеличения, таких как увеличительное стекло, лупы, и окуляры для телескопов и микроскопов.

Составной микроскоп

Схема составного микроскопа

В составном микроскопе для сбора света используется линза, расположенная близко к наблюдаемому объекту (так называемая цель объектив), который фокусирует реальное изображение объекта внутри микроскопа (изображение 1). Затем это изображение увеличивается с помощью второй линзы или группы линз (называемой окуляр ), который дает зрителю увеличенное перевернутое виртуальное изображение объекта (изображение 2).[3] Использование комбинированного объектива / окуляра позволяет получить гораздо большее увеличение. Обычные составные микроскопы часто оснащены сменными линзами объектива, что позволяет пользователю быстро регулировать увеличение.[3] Составной микроскоп также позволяет использовать более сложные настройки освещения, такие как фазовый контраст.

Другие варианты микроскопа

Существует множество вариантов конструкции составного оптического микроскопа специального назначения. Некоторые из них являются физическими конструктивными различиями, позволяющими использовать специализацию для определенных целей:

  • Стереомикроскоп, маломощный микроскоп, который обеспечивает стереоскопический обзор образца, обычно используемый для препарирования.
  • Сравнительный микроскоп, который имеет два отдельных световых пути, позволяющих напрямую сравнивать два образца через одно изображение в каждом глазу.
  • Инвертированный микроскоп, для изучения образцов снизу; полезен для клеточных культур в жидкости или для металлографии.
  • Микроскоп для осмотра оптоволоконных разъемов, предназначенный для проверки торцевых поверхностей разъемов
  • Путевой микроскоп, для изучения образцов высокого оптическое разрешение.

Другие варианты микроскопов рассчитаны на разные техники освещения:

Цифровой микроскоп

Миниатюра USB-микроскоп.
Основная статья: Цифровой микроскоп

А цифровой микроскоп микроскоп, оснащенный цифровая камера позволяя наблюдать за образцом через компьютер. Микроскопы также могут частично или полностью управляться компьютером с различными уровнями автоматизации. Цифровая микроскопия позволяет лучше анализировать изображение, полученное с микроскопа, например, измерять расстояния и площади, а также определять количество флуоресцентных или гистологический пятно.

Маломощные цифровые микроскопы, USB-микроскопы, также имеются в продаже. По сути, это веб-камеры с мощным макрообъектив и вообще не используйте просвечивание. Камера прикреплена непосредственно к USB порт компьютера, чтобы изображения отображались прямо на мониторе. Они предлагают небольшое увеличение (примерно до 200 ×) без необходимости использования окуляров и по очень низкой цене. Освещение высокой мощности обычно обеспечивается ВЕЛ источник или источники, расположенные рядом с объективом камеры.

Цифровая микроскопия с очень низким уровнем освещенности во избежание повреждения уязвимых биологических образцов доступна с использованием чувствительных счет фотонов цифровые фотоаппараты. Было продемонстрировано, что источник света, обеспечивающий пары запутанные фотоны может свести к минимуму риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом приложении призрачное изображение В микроскопии с разреженными фотонами образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно коррелируется с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективного получения изображений камерой для счета фотонов.[7]

История

Смотрите также: История оптики и Хронология микроскопических технологий

Изобретение

Самые ранние микроскопы были одиночными. линза увеличительные стекла с ограниченным увеличением, которые восходят, по крайней мере, к широкому использованию линз в очки в 13 веке.[8]

Составные микроскопы впервые появились в Европе около 1620 года.[9][10] включая один продемонстрированный Корнелис Дреббель в Лондоне (около 1621 г.) и один выставлен в Риме в 1624 г.[11][12]

Фактический изобретатель составного микроскопа неизвестен, хотя за эти годы было сделано много заявлений. К ним относится п. 35[13] лет спустя они появились нидерландский язык художник по очкам Иоганнес Захариассен, что его отец, Захариас Янссен, изобрел составной микроскоп и / или телескоп еще в 1590 году. Йоханнес (некоторые утверждают, что это сомнительно)[14][15][16] Свидетельства отодвигают дату изобретения так далеко назад, что Захария был ребенком в то время, что приводит к предположениям о том, что для справедливости утверждения Йоханнеса составной микроскоп должен был быть изобретен дедом Йоханнеса, Гансом Мартенсом.[17] Еще одно заявление: конкурент Янссена, Ганс Липперши (который подал заявку на первый патент на телескоп в 1608 году) также изобрел составной микроскоп.[18] Другие историки указывают на голландского новатора Корнелиса Дреббеля с его составным микроскопом 1621 года.[11][12]

Галилео Галилей также иногда упоминается как изобретатель сложного микроскопа. После 1610 года он обнаружил, что может близко сфокусировать свой телескоп, чтобы рассмотреть мелкие объекты, такие как мухи, крупным планом.[19] и / или могли смотреть не с той стороны в обратном направлении, чтобы увеличить небольшие объекты.[20] Единственным недостатком было то, что его телескоп длиной 2 фута пришлось удлинить до 6 футов, чтобы видеть объекты так близко.[21] Увидев составной микроскоп, построенный Дреббелем, выставленный в Риме в 1624 году, Галилей построил свою улучшенную версию.[11][12] В 1625 г. Джованни Фабер придумал название микроскоп для составного микроскопа Галилео, представленного в Accademia dei Lincei в 1624 г. [22] (Галилей назвал это "окчиолино" или же "маленький глаз"). Фабер придумал название из Греческий слова μικρόν (микрон) означает «маленький», и σκοπεῖν (skopein) означает «смотреть на», имя аналогично «телескоп ", еще одно слово, придуманное линийцами.[23]

Кристиан Гюйгенс Другой голландец в конце 17 века разработал простую двухлинзовую окулярную систему, которая была ахроматически исправлены, и, следовательно, огромный шаг вперед в развитии микроскопов. Окуляр Гюйгенса все еще производится по сей день, но он страдает небольшим размером поля зрения и другими незначительными недостатками.

Популяризация

Самый старый опубликованный снимок, сделанный с помощью микроскопа: пчелы Франческо Стеллути, 1630[24]

Антони ван Левенгук (1632–1724) считается, что микроскоп привлек внимание биологов, хотя простые увеличительные линзы производились уже в 16 веке. Самодельные микроскопы Ван Левенгука были простыми микроскопами с одной очень маленькой, но прочной линзой. Они были неудобны в использовании, но позволяли ван Левенгук видеть подробные изображения. Потребовалось около 150 лет оптических разработок, прежде чем составной микроскоп смог обеспечить изображение того же качества, что и простые микроскопы Ван Левенгука, из-за трудностей с настройкой нескольких линз. В 1850-х годах Джон Леонард Ридделл, Профессор химии Тулейнский университет, изобрел первый практический бинокулярный микроскоп при проведении одного из самых ранних и обширных американских микроскопических исследований холера.[25][26]

Техника освещения

Хотя основные микроскопические технологии и оптика доступны уже более 400 лет, гораздо позже были разработаны методы освещения образцов для получения изображений высокого качества, которые можно увидеть сегодня.

В августе 1893 г. Август Кёлер развитый Köhler освещение. Этот метод освещения образца обеспечивает чрезвычайно равномерное освещение и преодолевает многие ограничения старых методов освещения образца. До разработки освещения Келера изображение источника света, например лампочка нить накала, всегда была видна на изображении образца.

В Нобелевская премия по физике был награжден голландским физиком Фриц Зернике в 1953 году за разработку фазовый контраст освещение, позволяющее получать изображения прозрачных образцов. Используя вмешательство скорее, чем поглощение светлых, предельно прозрачных образцов, например живых млекопитающее клеток, можно получить изображение без использования методов окрашивания. Всего два года спустя, в 1955 году, Жорж Номарски опубликовал теорию для дифференциальный интерференционный контраст микроскопия, другой вмешательство техника визуализации.

Флуоресцентная микроскопия

Современная биологическая микроскопия во многом зависит от развития флуоресцентный зонды для определенных структур внутри клетки. В отличие от обычной просвечивающей световой микроскопии, в флуоресцентная микроскопия образец освещается через линзу объектива узким набором длин волн света. Этот свет взаимодействует с флуорофорами в образце, которые затем излучают более длительный свет. длина волны. Именно этот излучаемый свет составляет изображение.

С середины 20 века химические флуоресцентные красители, такие как DAPI который привязан к ДНК, были использованы для обозначения определенных структур внутри клетки. Более свежие разработки включают иммунофлуоресценция, который использует флуоресцентно помеченные антитела для распознавания определенных белков в образце и флуоресцентных белков, таких как GFP что живая клетка может выражать делая его флуоресцентным.

Составные части

Основные элементы оптического просвечивающего микроскопа (1990-е годы)

Все современные оптические микроскопы, предназначенные для просмотра образцов в проходящем свете, имеют одни и те же основные компоненты светового пути. Кроме того, подавляющее большинство микроскопов имеют одинаковые «структурные» компоненты.[27] (пронумерованы ниже в соответствии с изображением справа):

  • Окуляр (окулярная линза) (1)
  • Револьвер для объектива, револьвер или вращающаяся носовая часть (для удержания нескольких линз объектива) (2)
  • Объективные линзы (3)
  • Ручки фокусировки (для перемещения сцены)
    • Грубая регулировка (4)
    • Точная регулировка (5)
  • Этап (для удержания образца) (6)
  • Источник света (a свет или зеркало ) (7)
  • Диафрагма и конденсатор (8)
  • Механический этап (9)

Окуляр (окулярная линза)

Основная статья: Окуляр

В окуляр, или окулярная линза, представляет собой цилиндр, содержащий две или более линз; его функция заключается в том, чтобы сфокусировать изображение для глаза. Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Окуляры взаимозаменяемы, и в них можно вставлять много разных окуляров с разной степенью увеличения. Типичные значения увеличения для окуляров включают 5 ×, 10 × (наиболее распространенные), 15 × и 20 ×. В некоторых высокопроизводительных микроскопах оптическая конфигурация линзы объектива и окуляра согласована для обеспечения наилучших оптических характеристик. Чаще всего это происходит с апохроматический цели.

Целевая турель (револьвер или револьвер)

Башня объектива, револьвер или вращающаяся носовая часть - это часть, которая удерживает набор линз объектива. Это позволяет пользователю переключаться между линзами объектива.

Объектив

Основная статья: Объектив (оптика)

На нижнем конце типичного составного оптического микроскопа имеется один или несколько линзы объектива которые собирают свет от образца. Объектив обычно находится в цилиндрическом корпусе, содержащем стеклянную одно- или многоэлементную составную линзу. Обычно в круглую носовую часть ввинчиваются около трех линз объектива, которые можно поворачивать для выбора необходимой линзы объектива. Эти договоренности предназначены для парфокальный, что означает, что при смене одной линзы на другую на микроскопе образец остается в фокус. Объективы микроскопов характеризуются двумя параметрами, а именно: увеличение и числовая апертура. Первое обычно находится в диапазоне от 5 × до 100 ×, а второе - от 0,14 до 0,7, что соответствует фокусные расстояния примерно от 40 до 2 мм соответственно. Объективные линзы с большим увеличением обычно имеют более высокую числовую апертуру и более короткие глубина резкости в получившемся изображении. Для некоторых объективов с высокими характеристиками могут потребоваться согласованные окуляры для обеспечения наилучших оптических характеристик.

Объектив масляной иммерсии

Два Leica масляная иммерсия линзы объективов микроскопа: 100 × (слева) и 40 × (справа)
Основная статья: Погружение в масло

Некоторые микроскопы используют масляные иммерсионные объективы или водно-иммерсионные объективы для большего разрешения при большом увеличении. Они используются с индексный материал Такие как иммерсионное масло или вода и соответствующее покровное стекло между линзой объектива и образцом. Показатель преломления материала с согласованием показателей выше, чем у воздуха, что позволяет линзе объектива иметь большую числовую апертуру (больше 1), так что свет проходит от образца к внешней поверхности линзы объектива с минимальным преломлением. Числовая апертура может достигать 1,6.[28] Большая числовая апертура позволяет собирать больше света, делая возможным детальное наблюдение более мелких деталей. Масляные иммерсионные линзы обычно имеют увеличение от 40 до 100 ×.

Ручки фокусировки

Ручки регулировки перемещают столик вверх и вниз с раздельной регулировкой для грубой и точной фокусировки. Одинаковые элементы управления позволяют микроскопу адаптироваться к образцам разной толщины. В старых конструкциях микроскопов колеса регулировки фокуса перемещали трубку микроскопа вверх или вниз относительно стойки и имели фиксированный столик.

Рамка

Вся оптическая сборка традиционно крепится к жесткому рычагу, который, в свою очередь, прикрепляется к прочной U-образной ножке для обеспечения необходимой жесткости. Угол рычага может регулироваться, чтобы можно было регулировать угол обзора.

Рама служит точкой крепления для различных органов управления микроскопом. Обычно это включает элементы управления для фокусировки, как правило, большое колесо с накаткой для настройки грубой фокусировки вместе с меньшим колесиком с накаткой для управления точной фокусировкой. Другими функциями могут быть элементы управления лампой и / или элементы управления для регулировки конденсатора.

Этап

Столик представляет собой платформу под линзой объектива, которая поддерживает исследуемый образец. В центре предметного столика находится отверстие, через которое свет проходит для освещения образца. У сцены обычно есть руки, чтобы держать слайды (прямоугольные стеклянные пластины с типичными размерами 25 × 75 мм, на которых крепится образец).

При увеличении более 100 × перемещение слайда вручную нецелесообразно. Механический столик, типичный для микроскопов средней и более высокой ценовой категории, позволяет крошечным перемещением предметного стекла с помощью регуляторов, которые изменяют положение образца / предметного стекла по желанию. Если в микроскопе изначально не было механического предметного столика, возможно, его можно будет добавить.

Все этапы перемещаются вверх и вниз для фокусировки. С помощью механического предметного столика салазки перемещаются по двум горизонтальным осям для позиционирования образца для исследования деталей образца.

Фокусировка начинается при меньшем увеличении, чтобы пользователь мог центрировать образец на предметном столике. Для перехода к большему увеличению требуется, чтобы предметный столик был перемещен выше по вертикали для перефокусировки при большем увеличении, а также может потребоваться небольшая регулировка положения образца по горизонтали. Регулировка горизонтального положения образца является причиной использования механического столика.

Из-за сложности подготовки образцов и установки их на слайды детям лучше всего начинать с подготовленных слайдов, которые центрируются и легко фокусируются независимо от используемого уровня фокусировки.

Источник света

Можно использовать множество источников света. В простейшем случае дневной свет направляется через зеркало. Однако большинство микроскопов имеют собственный регулируемый и управляемый источник света - часто галогенная лампа, хотя освещение с использованием Светодиоды и лазеры становятся более распространенным положением. Köhler освещение часто предоставляется на более дорогих инструментах.

Конденсатор

В конденсатор линза, предназначенная для фокусировки света от источника освещения на образец. Конденсатор может также включать в себя другие функции, такие как диафрагма и / или фильтры, чтобы управлять качеством и интенсивностью освещения. Для техники освещения, например темное поле, фазовый контраст и дифференциальный интерференционный контраст Дополнительные оптические компоненты микроскопии должны быть точно выровнены на пути света.

Увеличение

Фактическая мощность или увеличение сложного оптического микроскопа - это произведение мощностей окуляра (окуляр ) и линзы объектива. Максимальные нормальные увеличения окуляра и объектива составляют 10 × и 100 × соответственно, что дает конечное увеличение 1000 ×.

Увеличение и микрофотографии

При использовании камеры для съемки микрофотография эффективное увеличение изображения должно учитывать размер изображения. Это не зависит от того, напечатан ли он на негативе пленки или отображается в цифровом виде на экран компьютера.

В случае фотопленочных фотоаппаратов расчет прост; Окончательное увеличение является произведением увеличения объектива, увеличения оптики камеры и коэффициента увеличения отпечатка пленки относительно негатива. Типичное значение коэффициента увеличения составляет около 5 раз (для случая 35 мм пленка и отпечаток размером 15 × 10 см (6 × 4 дюйма)).

В случае цифровых фотоаппаратов размер пикселей в CMOS или же CCD детектор и размер пикселей на экране должны быть известны. Затем можно рассчитать коэффициент увеличения от детектора до пикселей на экране. Как и в случае с пленочной камерой, окончательное увеличение является продуктом увеличения объектива, увеличения оптики камеры и коэффициента увеличения.

Операция

НАС. CBP Управление полевых операций агент, проверяющий подлинность из проездной документ загар Международный аэропорт используя стерео микроскоп

Техника освещения

Основная статья: Микроскопия

Доступны многие методы, которые изменяют световой путь для создания улучшенного контраст изображение из образца. Основные методы создания повышенного контраста образца включают: кросс-поляризованный свет, темное поле, фазовый контраст и дифференциальный интерференционный контраст освещение. Недавняя техника (Сарфус ) объединяет кросс-поляризованный свет и специальные слайды с повышенной контрастностью для визуализации нанометрических образцов.

Другие техники

Современные микроскопы позволяют не только наблюдать изображение образца в проходящем свете; есть много методов, которые можно использовать для извлечения других типов данных. Большинство из них требует дополнительного оборудования в дополнение к основному составному микроскопу.

  • Отраженный свет или падающее освещение (для анализа поверхностных структур)
  • Флуоресцентная микроскопия, как:
  • Микроспектроскопия (где УФ-видимый спектрофотометр интегрирован с оптическим микроскопом)
  • Ультрафиолетовая микроскопия
  • Ближняя инфракрасная микроскопия
  • Множественная просвечивающая микроскопия[29] для увеличения контрастности и уменьшения аберраций.
  • Автоматизация (для автоматического сканирования большого образца или захвата изображения)

Приложения

Изображение клеток в медицинском учреждении с 40-кратным увеличением. мазок снято через оптический микроскоп с помощью мокрое крепление техника, размещение образца на предметном стекле и смешивание с солевым раствором

Оптическая микроскопия широко используется в микроэлектронике, нанофизике, биотехнологии, фармацевтических исследованиях, минералогии и микробиологии.[30]

Оптическая микроскопия используется для медицинский диагноз, поле, называемое гистопатология при работе с тканями или в мазок на свободные клетки или фрагменты ткани.

В промышленном использовании широко распространены бинокулярные микроскопы. Помимо приложений, требующих истинного восприятие глубины, использование двойных окуляров снижает напряжение глаз связанные с долгими рабочими днями на станции микроскопии. В некоторых случаях используются микроскопы с большим рабочим расстоянием или длиннофокусные микроскопы.[31] полезны. Может потребоваться осмотр предмета за окно, или промышленные объекты могут представлять опасность для цели. Такая оптика напоминает телескопы с возможностью фокусировки на близком расстоянии.[32][33]

Измерительные микроскопы используются для точных измерений. Есть два основных типа. сетка градуированная для измерения расстояний в фокальной плоскости.[34] Другой (и более старый) тип имеет простой перекрестие и микрометрический механизм для перемещения объекта относительно микроскопа.[35]

Очень маленькие портативные микроскопы нашли применение в тех местах, где лабораторный микроскоп был бы обузой.[36]

Ограничения

Предел дифракции высечен в камне на памятнике Эрнст Аббе.

При очень большом увеличении в проходящем свете точечные объекты выглядят как нечеткие диски, окруженные дифракция кольца. Они называются Воздушные диски. В разрешающая способность Под микроскопом понимается способность различать два близко расположенных диска Эйри (или, другими словами, способность микроскопа выявлять соседние структурные детали как отдельные и отдельные). Именно эти эффекты дифракции ограничивают возможность разрешения мелких деталей. На протяженность и величину дифракционных картин влияют как длина волны из свет (λ) преломляющие материалы, использованные для изготовления линзы объектива и числовая апертура (NA) линзы объектива. Следовательно, существует конечный предел, за которым невозможно разрешить отдельные точки в объективном поле, известном как предел дифракции. Предполагая, что оптические аберрации во всей оптической системе пренебрежимо малы, разрешение d, можно записать как:

Обычно предполагается длина волны 550 нм, что соответствует зеленый свет. С воздуха как внешняя среда, высшая практическая NA составляет 0,95, а с маслом - до 1,5. На практике наименьшее значение d достижимая с помощью обычных линз, составляет около 200 нм. Новый тип линз, использующий многократное рассеяние света, позволил улучшить разрешение до менее 100 нм.[37]

Превышение предела разрешения

Доступны несколько методов для достижения разрешений, превышающих предел пропускаемого света, описанный выше. Голографические методы, описанные Куржоном и Булабуа в 1979 году, также способны нарушить этот предел разрешения, хотя разрешение было ограничено в их экспериментальном анализе.[38]

Для использования флуоресцентных образцов доступно больше методов. Примеры включают Вертико СМИ, сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля который использует мимолетные волны, и истощение стимулированных выбросов. В 2005 году микроскоп, способный обнаруживать одну молекулу, был описан как обучающий инструмент.[39]

Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее десятилетие, методы преодоления дифракционного предела остаются ограниченными и специализированными.

Хотя большинство методов ориентированы на увеличение латерального разрешения, существуют также некоторые методы, позволяющие анализировать очень тонкие образцы. Например, сарфус Методы помещают тонкий образец на усиливающую контраст поверхность и, таким образом, позволяют непосредственно визуализировать пленки толщиной всего 0,3 нанометра.

8 октября 2014 г. Нобелевская премия по химии был присужден Эрик Бетциг, Уильям Мёрнер и Стефан Ад для развития сверхрешенных флуоресцентная микроскопия.[40][41]

Структурированное освещение SMI

SMI (микроскопия с пространственно модулированным освещением) - это светооптический процесс так называемого функция разброса точки (PSF) инжиниринг. Это процессы, которые изменяют PSF микроскоп подходящим образом для увеличения оптического разрешения, чтобы максимизировать точность расстояние измерения флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длина волны освещающего света или для извлечения других структурных параметров в нанометровом диапазоне.[42][43]

Локализационная микроскопия СПДМфимод

3D Dual Color Super Resolution Microscopy Cremer from 2010
Двухцветная 3D микроскопия со сверхвысоким разрешением с Her2 и Her3 в клетках груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия), основная технология локализационной микроскопии представляет собой светооптический процесс флуоресцентная микроскопия который позволяет измерять положение, расстояние и угол на "оптически изолированных" частицах (например, молекулах) значительно ниже теоретического предел разрешения для световой микроскопии. «Оптически изолированный» означает, что в данный момент времени только одна частица / молекула в области размера, определяемого обычным оптическим разрешением (обычно приблизительно 200–250 нм. диаметр ) проходит регистрацию. Это возможно, когда молекулы в пределах такой области все несут разные спектральные маркеры (например, разные цвета или другие полезные различия в световое излучение различных частиц).[44][45][46][47]

Многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP, Красители Alexa, красители Atto, молекулы Cy2 / Cy3 и флуоресцеина могут быть использованы для локализационной микроскопии при наличии определенных фото-физических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для создания наноизображений достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности.[48]

3D микроскопия сверхвысокого разрешения

Трехмерная микроскопия сверхвысокого разрешения со стандартными флуоресцентными красителями может быть достигнута путем сочетания локализационной микроскопии для стандартных флуоресцентных красителей SPDMphymod и структурированного освещения SMI.[49]

STED

Микроскопия стимулированного истощения эмиссии (STED) филаментов актина внутри клетки.

Истощение вынужденных выбросов является простым примером того, как возможно более высокое разрешение, превышающее дифракционный предел, но оно имеет серьезные ограничения. STED - это метод флуоресцентной микроскопии, который использует комбинацию световых импульсов для индукции флуоресценции в небольшой подгруппе флуоресцентных молекул в образце. Каждая молекула создает на изображении световое пятно с ограничением дифракции, и центр каждого из этих пятен соответствует местоположению молекулы. Поскольку количество флуоресцирующих молекул невелико, пятна света вряд ли будут перекрываться и поэтому могут быть размещены точно. Затем этот процесс повторяется много раз для создания изображения. Стефан Ад Института биофизической химии Макса Планка был удостоен 10-й премии Германии за будущее в 2006 г. и Нобелевской премии по химии в 2014 г. за разработку микроскопа STED и связанных с ним методологий.[50]

Альтернативы

Чтобы преодолеть ограничения, установленные пределом дифракции видимого света, были разработаны другие микроскопы, в которых используются другие волны.

Важно отметить, что более высокочастотные волны имеют ограниченное взаимодействие с веществом, например, мягкие ткани относительно прозрачны для рентгеновских лучей, что приводит к различным источникам контраста и различным целевым приложениям.

Использование электронов и рентгеновских лучей вместо света обеспечивает гораздо более высокое разрешение - длина волны излучения короче, поэтому дифракционный предел ниже. Чтобы сделать коротковолновый зонд неразрушающим, система формирования изображения атомным пучком (атомный наноскоп ) был предложен и широко обсуждается в литературе, но пока не может конкурировать с традиционными системами визуализации.

СТМ и АСМ - это методы сканирующего зонда с использованием небольшого зонда, который сканируется по поверхности образца. Разрешение в этих случаях ограничено размером зонда; Методы микромеханической обработки позволяют производить зонды с радиусом кончика 5–10 нм.

Кроме того, в таких методах, как электронная или рентгеновская микроскопия, используется вакуум или частичный вакуум, что ограничивает их использование для живых и биологических образцов (за исключением сканирующий электронный микроскоп для окружающей среды ). Камеры для образцов, необходимые для всех таких инструментов, также ограничивают размер образца, и манипуляции с образцом более трудны. На изображениях, полученных с помощью этих методов, цвет не виден, поэтому некоторая информация теряется. Однако они необходимы при исследовании молекулярных или атомных эффектов, таких как возрастное упрочнение в алюминиевые сплавы, или микроструктура из полимеры.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Дж. Р. Блуфорд. «Урок 2 - страница 3, КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРОСКОПОВ». msnucleus.org. В архиве с оригинала 10 мая 2016 г.. Получено 15 января 2017.
  2. ^ Системы знаний Триши. Серия IIT Foundation - Physics Class 8, 2 / e. Pearson Education India. п. 213. ISBN  978-81-317-6147-2.
  3. ^ а б Ян М. Ватт (1997). Принципы и практика электронной микроскопии. Издательство Кембриджского университета. п. 6. ISBN  978-0-521-43591-8.
  4. ^ «Покупка дешевого микроскопа для домашнего использования» (PDF). Оксфордский университет. В архиве (PDF) из оригинала 5 марта 2016 г.. Получено 5 ноября 2015.
  5. ^ Кумар, Нареш; Weckhuysen, Bert M .; Уэйн, Эндрю Дж .; Поллард, Эндрю Дж. (Апрель 2019 г.). «Наноразмерная химическая визуализация с использованием рамановской спектроскопии с усилением наконечника». Протоколы природы. 14 (4): 1169–1193. Дои:10.1038 / s41596-019-0132-z. ISSN  1750-2799. PMID  30911174.
  6. ^ Ли, Джунхи; Крэмптон, Кевин Т .; Талларида, Николай; Апкарян, В. Ара (апрель 2019 г.). «Визуализация колебательных нормальных мод одиночной молекулы с атомарно ограниченным светом». Природа. 568 (7750): 78–82. Дои:10.1038 / s41586-019-1059-9. ISSN  1476-4687. PMID  30944493.
  7. ^ Aspden, Reuben S .; Gemmell, Nathan R .; Моррис, Питер А .; Tasca, Daniel S .; Мертенс, Лена; Таннер, Майкл Дж .; Кирквуд, Роберт А .; Руджери, Алессандро; Този, Альберто; Бойд, Роберт В .; Buller, Gerald S .; Хэдфилд, Роберт Х .; Паджетт, Майлз Дж. (2015). «Фотонно-разреженная микроскопия: визуализация в видимом свете с использованием инфракрасного освещения» (PDF). Optica. 2 (12): 1049. Дои:10.1364 / OPTICA.2.001049. ISSN  2334-2536.
  8. ^ Atti Della Fondazione Giorgio Ronchi E Contributi Dell'Istituto Nazionale Di Ottica, Том 30, La Fondazione-1975, стр. 554
  9. ^ Альберт Ван Хелден; Свен Дюпре; Роб ван Гент (2010). Истоки телескопа. Издательство Амстердамского университета. п. 24. ISBN  978-90-6984-615-6.
  10. ^ Уильям Розенталь, Очки и другие вспомогательные средства зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391–392.
  11. ^ а б c Раймонд Дж. Сигер, Люди-физики: Галилео Галилей, его жизнь и работы, Elsevier - 2016, стр. 24
  12. ^ а б c Дж. Уильям Розенталь, Очки и другие вспомогательные средства зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391
  13. ^ Альберт Ван Хелден; Свен Дюпре; Роб ван Гент (2010). Истоки телескопа. Издательство Амстердамского университета. С. 32–36, 43. ISBN  978-90-6984-615-6.
  14. ^ Ван Хелден, п. 43
  15. ^ Шмаевский, Брайан (2006) Биотехнология 101. Гринвуд. п. 171. ISBN  0313335281.
  16. ^ Примечание: истории разнятся, в том числе Захариас Янссен получил помощь от своего отца Ганса Мартенса (или, как иногда говорят, полностью построил его отец). Вероятная дата рождения Захарии - 1585 г. (Ван Хелден, п. 28) делает маловероятным, что он изобрел его в 1590 году, и заявление об изобретении основано на показаниях сына Захариаса Янссена, Иоганнеса Захариассена, который, возможно, сфабриковал всю историю (Ван Хелден, п. 43).
  17. ^ Брайан Шмаефски, Биотехнология 101 - 2006, стр. 171
  18. ^ "Кто изобрел микроскоп?". В архиве из оригинала от 3 февраля 2017 г.. Получено 31 марта 2017.
  19. ^ Роберт Д. Уэрта, Делфтские гиганты: Йоханнес Вермеер и натурфилософы: параллельный поиск знаний в эпоху открытий, Bucknell University Press - 2003, стр. 126
  20. ^ А. Марк Смит, От взгляда к свету: переход от древней к современной оптике, University of Chicago Press - 2014, стр. 387
  21. ^ Дэниел Дж. Бурстин, Первооткрыватели, Knopf Doubleday Publishing Group - 2011, стр. 327
  22. ^ Гулд, Стивен Джей (2000). «Глава 2: Зоркая рысь, обманутая природой». Лежащие камни Марракеша: предпоследние размышления в естествознании. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Гармония. ISBN  978-0-224-05044-9.
  23. ^ "Il microscopio di Galileo" В архиве 9 апреля 2008 г. Wayback Machine, Instituto e Museo di Storia della Scienza (на итальянском языке)
  24. ^ Гулд, Стивен Джей (2000) Лежащие камни Марракеша. Книги гармонии. ISBN  0-609-60142-3.
  25. ^ Ридделл Дж. Л. (1854 г.). «О бинокулярном микроскопе». Q J Microsc Sci. 2: 18–24.
  26. ^ Касседи JH (1973). "John L. Riddell's Vibrio biceps: Two documents on American microscopy and cholera etiology 1849–59". J Hist Med. 28 (2): 101–108.
  27. ^ How to Use a Compound Microscope В архиве 1 сентября 2013 г. Wayback Machine. microscope.com
  28. ^ Kenneth, Spring; Keller, H. Ernst; Дэвидсон, Майкл В. "Microscope objectives". Olympus Microscopy Resource Center. В архиве из оригинала 1 ноября 2008 г.. Получено 29 октября 2008.
  29. ^ N. C. Pégard and J. W. Fleischer, "Contrast Enhancement by Multi-Pass Phase-Conjugation Microscopy," CLEO:2011, paper CThW6 (2011).
  30. ^ O1 Optical Microscopy В архиве 24 января 2011 г. Wayback Machine By Katarina Logg. Chalmers Dept. Applied Physics. 20 января 2006 г.
  31. ^ "Long-focus microscope with camera adapter". macrolenses.de. В архиве from the original on 3 October 2011.
  32. ^ "Questar Maksutov microscope". company7.com. Архивировано из оригинал 15 июня 2011 г.. Получено 11 июля 2011.
  33. ^ "FTA long-focus microscope". firsttenangstroms.com. Архивировано из оригинал 26 февраля 2012 г.. Получено 11 июля 2011.
  34. ^ Gustaf Ollsson, Reticles, Encyclopedia of Optical Engineering, Vol. 3, CRC, 2003; page 2409.
  35. ^ Appendix A, Журнал Королевского микроскопического общества, 1906; page 716. A discussion of Zeiss measuring microscopes.
  36. ^ Linder, Courtney (22 November 2019). "If You've Ever Wanted a Smartphone Microscope, Now's Your Chance". Популярная механика. Получено 3 ноября 2020.
  37. ^ Van Putten, E. G.; Akbulut, D.; Bertolotti, J.; Vos, W. L.; Lagendijk, A.; Mosk, A. P. (2011). "Scattering Lens Resolves Sub-100 nm Structures with Visible Light". Письма с физическими проверками. 106 (19): 193905. arXiv:1103.3643. Bibcode:2011PhRvL.106s3905V. Дои:10.1103/PhysRevLett.106.193905. PMID  21668161.
  38. ^ Courjon, D.; Bulabois, J. (1979). "Real Time Holographic Microscopy Using a Peculiar Holographic Illuminating System and a Rotary Shearing Interferometer". Журнал оптики. 10 (3): 125. Bibcode:1979JOpt...10..125C. Дои:10.1088/0150-536X/10/3/004.
  39. ^ "Demonstration of a Low-Cost, Single-Molecule Capable, Multimode Optical Microscope". В архиве из оригинала от 6 марта 2009 г.. Получено 25 февраля 2009.
  40. ^ Риттер, Карл; Восход, Малин (8 октября 2014 г.). «2 американца, 1 немец получили Нобелевскую премию по химии». AP Новости. В архиве из оригинала 11 октября 2014 г.. Получено 8 октября 2014.
  41. ^ Чанг, Кеннет (8 октября 2014 г.). «2 американца и немец удостоены Нобелевской премии по химии». Нью-Йорк Таймс. В архиве из оригинала 9 октября 2014 г.. Получено 8 октября 2014.
  42. ^ Heintzmann, Rainer (1999). Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. 3568. С. 185–196. Дои:10.1117/12.336833.
  43. ^ Кремер, Кристоф; Hausmann, Michael; Bradl, Joachim and Schneider, Bernhard "Wave field microscope with detection point spread function", U.S. Patent 7,342,717 , priority date 10 July 1997
  44. ^ Lemmer, P.; Gunkel, M.; Baddeley, D.; Kaufmann, R .; Urich, A.; Weiland, Y.; Reymann, J.; Müller, P.; Hausmann, M.; Cremer, C. (2008). "SPDM: light microscopy with single-molecule resolution at the nanoscale". Прикладная физика B. 93 (1): 1–12. Bibcode:2008ApPhB..93....1L. Дои:10.1007/s00340-008-3152-x.
  45. ^ Bradl, Joachim (1996). "Comparative study of three-dimensional localization accuracy in conventional, confocal laser scanning and axial tomographic fluorescence light microscopy". In Bigio, Irving J; Grundfest, Warren S; Schneckenburger, Herbert; Svanberg, Katarina; Viallet, Pierre M (eds.). Optical Biopsies and Microscopic Techniques. Optical Biopsies and Microscopic Techniques. 2926. С. 201–206. Дои:10.1117/12.260797.
  46. ^ Heintzmann, R.; Münch, H.; Cremer, C. (1997). "High-precision measurements in epifluorescent microscopy – simulation and experiment" (PDF). Cell Vision. 4: 252–253. В архиве (PDF) из оригинала 16 февраля 2016 г.
  47. ^ Кремер, Кристоф; Hausmann, Michael; Bradl, Joachim and Rinke, Bernd "Method and devices for measuring distances between object structures", U.S. Patent 6,424,421 priority date 23 December 1996
  48. ^ Manuel Gunkel; и другие. (2009). "Dual color localization microscopy of cellular nanostructures" (PDF). Биотехнологический журнал. 4 (6): 927–38. Дои:10.1002/biot.200900005. PMID  19548231.
  49. ^ Kaufmann, R; Müller, P; Hildenbrand, G; Hausmann, M; Cremer, C; и другие. (2011). «Анализ кластеров мембранного белка Her2 / neu в различных типах клеток рака груди с использованием микроскопии локализации». Журнал микроскопии. 242 (1): 46–54. CiteSeerX  10.1.1.665.3604. Дои:10.1111 / j.1365-2818.2010.03436.x. PMID  21118230.
  50. ^ "German Future Prize for crossing Abbe's Limit". В архиве из оригинала 7 марта 2009 г.. Получено 24 февраля 2009.

Цитированные источники

  • Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Истоки телескопа. Издательство Амстердамского университета. ISBN  978-9069846156.

дальнейшее чтение

  • "Metallographic and Materialographic Specimen Preparation, Light Microscopy, Image Analysis and Hardness Testing", Kay Geels in collaboration with Struers A/S, ASTM International 2006.
  • "Light Microscopy: An ongoing contemporary revolution", Siegfried Weisenburger and Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.

внешняя ссылка