Зонд гибридизации - Hybridization probe

В молекулярная биология, а гибридизационный зонд это фрагмент ДНК или же РНК переменной длины (обычно 100–10000 баз), которая может быть радиоактивно или с флуоресцентной меткой. Затем его можно использовать в образцах ДНК или РНК для обнаружения присутствия нуклеотид вещества (мишень РНК), которые дополнительный к последовательности в зонде. Таким образом, зонд гибридизуется с одноцепочечной нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК), последовательность оснований которой позволяет зонд-мишень базовая пара из-за комплементарности между зондом и целью.[1] Помеченный зонд является первым денатурированный (при нагревании или под щелочной такие условия, как воздействие едкий натр ) в одноцепочечную ДНК (оцДНК), а затем гибридизуют с целевой оцДНК (Саузерн-блоттинг ) или РНК (северный блоттинг ) иммобилизованный на мембране или на месте.Обнаружить гибридизация зонда к его целевой последовательности, зонд помечен (или «помечен») с помощью молекулярный маркер радиоактивных или (совсем недавно) флуоресцентных молекул; обычно используемые маркеры 32п (а радиоактивный изотоп из фосфор включены в фосфодиэфир связь в ДНК зонда) или дигоксигенин, который является нерадиоактивным, антитело маркер на основе. Последовательности ДНК или транскрипты РНК, которые имеют умеренное или высокое сходство последовательностей с зондом, затем обнаруживаются путем визуализации гибридизированного зонда через авторадиография или другие методы визуализации. Обычно либо делается рентгеновский снимок фильтра, либо фильтр помещается в УФ-свет. Обнаружение последовательностей с умеренным или высоким сходством зависит от того, насколько жесткими были применены условия гибридизации - высокая строгость, такая как высокая температура гибридизации и низкая соль в гибридизационных буферах, допускает только гибридизацию между нуклеиновая кислота последовательности, которые очень похожи, тогда как низкая строгость, такая как низкая температура и высокая соль, позволяет гибридизоваться, когда последовательности менее похожи. Зонды гибридизации, используемые в ДНК микрочипы относятся к ДНК, ковалентно прикрепленной к инертной поверхности, такой как предметные стекла с покрытием или генные чипы, с которой гибридизируется мобильная кДНК-мишень.

В зависимости от метод, зонд может быть синтезированный с использованием фосфорамидит метод, или он может быть сгенерирован и помечен ПЦР усиление или клонирование (оба более старые методы). Чтобы увеличить in vivo стабильность зонда РНК не используется. Вместо, Аналоги РНК может использоваться, в частности морфолино - производные. Зонды на основе молекулярной ДНК или РНК в настоящее время обычно используются при скрининге библиотек генов, обнаружении нуклеотидных последовательностей методами блоттинга и в других генных технологиях, таких как нуклеиновые кислоты и ткани. микрочипы.

Примеры зондов

Использование в микробной экологии

В области микробная экология олигонуклеотидные зонды используются для определения присутствия микробных видов, родов или микроорганизмов, классифицированных на более широком уровне, например бактерии, археи, и эукариоты через флуоресценция in situ гибридизация (РЫБЫ).[2] Зонды рРНК позволили ученым визуализировать микроорганизмы, которые еще предстоит культивировать в лабораторных условиях, путем извлечения последовательностей рРНК непосредственно из окружающей среды.[3] Примеры этих типов микроорганизмов включают:

  • Невская Рамоса: N. ramosa бактерия-нейстон, образующая типичные дихотомически разветвленные розетки на поверхности мелководных пресноводных местообитаний.[4]
  • Ахроматиум оксалиферум: Эта огромная бактерия (длина клеток до> 100 мкм, диаметр до 50 мкм) содержит глобулы серы и массивные включения кальцита и обитает в верхних слоях пресноводных отложений. Он виден невооруженным глазом и из-за своей устойчивости к выращиванию озадачил поколения микробиологов.[5]

Ограничения

В некоторых случаях различие между видами может быть проблематичным при использовании 16S рРНК последовательности из-за сходства. В таких случаях 23S рРНК может быть лучшей альтернативой.[6] Глобальная стандартная библиотека последовательностей рРНК постоянно увеличивается и постоянно обновляется, и, следовательно, возможность случайного события гибридизации между специально разработанным зондом (на основе полных и текущих данных от ряда тестовых организмов) и нежелательным / неизвестным целевой организм не может быть легко отклонен.[7] Напротив, вполне вероятно, что существуют микроорганизмы, которые еще предстоит идентифицировать, которые филогенетически являются членами целевой группы зонда, но имеют частичные или почти идеальные сайты-мишени. обычно применяется при разработке зондов для конкретных групп.

Вероятно, самым большим практическим ограничением этого метода является отсутствие доступной автоматизации.[8]

Использование в судебной медицине

В судебной медицине зонды гибридизации используются, например, для обнаружения коротких тандемных повторов (микроспутник ) и в полиморфизме длин рестрикционных фрагментов (RFLP ) методы, все из которых широко используются как часть ДНК-профилирование анализ.

Рекомендации

  1. ^ «Гибридизации нуклеиновых кислот». www.ndsu.edu. Получено 2017-05-26.
  2. ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомные РНК, для исследований в области микробной экологии». Обзор микробиологии FEMS. 24 (5): 555–565. Дои:10.1111 / j.1574-6976.2000.tb00557.x. PMID  11077149.
  3. ^ Amann, R .; Ludwig, W .; Шлейфер, К.-Х. (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ отдельных микробных клеток без культивирования». Микробиологические обзоры. 59: 143–169. Дои:10.1128 / MMBR.59.1.143-169.1995.
  4. ^ Glöckner, F.O .; Babenzien H.D .; Аманн Р. (1998). «Филогения и идентификация in situ Невская Рамоса". Appl. Environ. Микробиол. 64 (5): 1895–1901. Дои:10.1128 / AEM.64.5.1895-1901.1998.
  5. ^ Glöckner, F.O .; Babenzien H.D .; Аманн Р. (1999). «Филогения и разнообразие Ахроматиум оксалиферум". Syst. Appl. Микробиол. 22 (1): 28–38. Дои:10.1016 / s0723-2020 (99) 80025-3. PMID  10188276.
  6. ^ Fox, G.E .; Wisotzkey, J.D .; Юрчук-младший, П. (1992). «Насколько близко: идентичность последовательности 16S рРНК может быть недостаточной для гарантии видовой идентичности». Int. J. Syst. Бактериол. 42 (1): 166–170. Дои:10.1099/00207713-42-1-166. PMID  1371061.
  7. ^ Olsen, G.J .; Lane, D.J .; Giovannoni, S.J .; Pace, N.R .; Шталь, Д.А. (1986). «Микробная экология и эволюция: подход к рибосомной РНК». Анну. Rev. Microbiol. 40: 337–365. Дои:10.1146 / annurev.mi.40.100186.002005. PMID  2430518.
  8. ^ Аманн Р., Людвиг В. (2000). «Зонды нуклеиновых кислот, нацеленные на рибосомные РНК, для исследований в области микробной экологии». Обзор микробиологии FEMS. 24 (5): 555–565. Дои:10.1111 / j.1574-6976.2000.tb00557.x. PMID  11077149.