Технология циклического датчика - Cycling probe technology

Технология циклического датчика (CPT) - это молекулярно-биологический метод выявления специфических ДНК последовательности. CPT работает под изотермический условия. В некоторых приложениях CPT предлагает альтернативу ПЦР. Однако, в отличие от ПЦР, CPT не генерирует множественные копии самой целевой ДНК, и амплификация сигнала является линейной, в отличие от экспоненциальной амплификации целевой ДНК в ПЦР. CPT использует химерный зонд, специфичный для последовательности, который гибридизуется с комплементарной последовательностью целевой ДНК и становится субстратом для РНКаза H. Расщепление происходит в межнуклеотидных связях РНК и приводит к диссоциации зонда от мишени, что делает его доступным для следующей молекулы зонда.[1] Интегрированные электрокинетические системы были разработаны для использования в CPT.[2]

Зонд

В технологии циклического датчика используется химерный зонд нуклеиновой кислоты обнаруживать наличие определенного ДНК последовательность. Химерный зонд состоит из РНК сегмент зажат между двумя сегментами ДНК. Сегмент РНК содержит 4 смежных пурин нуклеотиды. Зонды должны быть менее 30 нуклеотидов в длину и спроектированы так, чтобы минимизировать внутризондовое и межзондовое взаимодействия.[3]

Процесс

Технология циклического датчика использует циклический изотермический процесс, который начинается с гибридизация химерного зонда с целевой ДНК. После гибридизации зонд становится подходящим субстратом для РНКаза H. РНКаза H, an эндонуклеаза, расщепляет РНК-часть зонда, в результате чего образуются два химерных фрагмента. В температура плавления (Тм) вновь отколотых фрагментов ниже температуры плавления исходного зонда. Поскольку реакция СРТ изотермически поддерживается чуть выше точки плавления исходного зонда, отщепленные фрагменты диссоциируют от целевой ДНК. После диссоциации целевая ДНК может свободно гибридизоваться с новым зондом, начиная цикл снова.[3][4]

После того, как фрагменты были расщеплены и диссоциированы, их можно обнаружить. Обычная стратегия обнаружения фрагментов включает: флуоресценция. С помощью этого метода флуоресцентный маркер прикрепляется к 5 ’концу зонда и тушитель прикреплен к 3 'концу зонда.[4][5] Когда РНКаза Н расщепляет зонд, тушитель и флуоресцентный маркер разделяются, увеличивая интенсивность флуоресцентного маркера. В качестве альтернативы отщепленные фрагменты можно обнаружить с помощью амплификации (например, ПЦР ) или дальнейшая модификация, позволяющая использовать другие химические средства обнаружения.[6]

При работе с небольшими концентрациями целевой ДНК протокол CPT может быть изменен для повышения специфичности и эффективности. Было показано, что увеличение выделенного времени улучшает эффективность расщепления зонда.[4] Было показано, что как увеличение концентрации РНКазы H, так и использование зонда, не подверженного межзондовым и внутризондовым взаимодействиям, увеличивают специфичность.[3]

Преимущества

Поскольку технология циклического зонда не включает амплификацию целевой ДНК, CPT имеет более низкий риск перекрестное загрязнение чем ПЦР.[3][4] Кроме того, CPT быстрее, чем PCR.[4] и не требует специального термоциклер. CPT также не требует запуска продуктов CPT на гель.

Недостатки

Для CPT требуются специализированные химерные зонды, что делает анализ CPT более дорогим, чем ПЦР.[5] Поскольку зонды CPT настолько специфичны, для каждого уникального анализа необходимо разрабатывать новый зонд, что дополнительно увеличивает стоимость. Клиническая реализация затруднена в финансовом отношении, но также ограничена возможностью образцов, содержащих неспецифические РНКазы кроме РНКазы H.[3]

Приложения

CPT может использоваться для обнаружения специфических последовательностей ДНК и специфических расширений. генотипы. Например, CPT можно использовать для различения ГМО производить из продуктов без ГМО.[5] Клинически CPT может использоваться как альтернатива культивированию клеток для выявления антибактериальная устойчивость возбудителя.[4]

CPT, по своей сути, определяет, присутствует ли определенная последовательность в образце. Но поскольку расщепленные зонды накапливаются после линейная кинетика скорости количество целевой ДНК может быть определено количественно. Следовательно, CPT использовался для количественной оценки количества некодирующих повторов в организмах.[3]

CPT можно использовать вместе с другими технологиями, например молекулярные маяки и КПЦР.[7]

Рекомендации

  1. ^ Бхатт Р., Скотт Б., Уитни С., Брайан Р.Н., Клони Л., Лебедев А. (1999). «Обнаружение нуклеиновых кислот с помощью технологии циклического зонда на магнитных частицах: высокая чувствительность и простота разделения». Нуклеозиды и нуклеотиды. 18 (6–7): 1297–9. Дои:10.1080/07328319908044696. PMID  10474219.
  2. ^ Тан Т., Бадал М.Ю., Оквирк Дж., Ли В.Е., Бадер Д.Е., Беккауи Ф., Харрисон Д.Д. (февраль 2002 г.). «Интегрированная микрофлюидная система электрофореза для анализа генетических материалов с использованием методов усиления сигнала». Аналитическая химия. 74 (4): 725–33. Дои:10.1021 / ac010874j. PMID  11866051.
  3. ^ а б c d е ж Beggs ML, Cave MD, Marlowe C, Cloney L, Duck P, Eisenach KD (декабрь 1996 г.). «Характеристика прямой повторяющейся последовательности комплекса Mycobacterium tuberculosis для использования в реакции циклического зонда». Журнал клинической микробиологии. 34 (12): 2985–9. Дои:10.1128 / JCM.34.12.2985-2989.1996. ЧВК  229446. PMID  8940435.
  4. ^ а б c d е ж Фонг В.К., Модрусан З., МакНевин Дж. П., Маростенмаки Дж., Зин Б., Беккауи Ф. (июль 2000 г.). «Быстрый твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения метициллин-устойчивого золотистого стафилококка с использованием технологии циклического зонда». Журнал клинической микробиологии. 38 (7): 2525–9. Дои:10.1128 / JCM.38.7.2525-2529.2000. ЧВК  86959. PMID  10878037.
  5. ^ а б c Бух Гаспарич М., Чанкар К., Зел Дж., Груден К. (март 2008 г.). «Сравнение различных химических методов ПЦР в реальном времени и их пригодность для обнаружения и количественной оценки генетически модифицированных организмов». BMC Biotechnology. 8: 26. Дои:10.1186/1472-6750-8-26. ЧВК  2322970. PMID  18325084.
  6. ^ Уолкотт MJ (октябрь 1992 г.). «Достижения в методах обнаружения на основе нуклеиновых кислот». Обзоры клинической микробиологии. 5 (4): 370–86. Дои:10,1128 / см 5.4.370. ЧВК  358255. PMID  1423216.
  7. ^ Jacroux T, Rieck DC, Cui R, Ouyang Y, Dong WJ (январь 2013 г.). «Ферментативная амплификация передачи сигналов гибридного молекулярного маяка ДНК / РНК при обнаружении нуклеиновых кислот». Аналитическая биохимия. 432 (2): 106–14. Дои:10.1016 / j.ab.2012.09.015. ЧВК  3522425. PMID  23000602.