Термодинамика нуклеиновых кислот - Nucleic acid thermodynamics

Термодинамика нуклеиновых кислот это исследование того, как температура влияет на структура нуклеиновой кислоты двухцепочечного ДНК (дцДНК). Температура плавления (Тм) определяется как температура, при которой половина нитей ДНК находится в случайный катушки или одноцепочечное (оцДНК) состояние. Тм зависит от длины молекулы ДНК и ее специфики нуклеотид последовательность. ДНК, когда она находится в состоянии, когда две ее цепи диссоциированы (т. Е. Молекула дцДНК существует как две независимые цепи), упоминается как подвергшаяся диссоциации. денатурированный высокой температурой.

Концепции

Гибридизация

Основная статья: Гибридизация (молекулярная биология)

Гибридизация - это процесс создания нековалентный, специфичное для последовательности взаимодействие между двумя или более дополнительный нити нуклеиновые кислоты в единый комплекс, который в случае двух цепей называется дуплекс. Олигонуклеотиды, ДНК, или же РНК будут связываться со своим комплементом в нормальных условиях, поэтому две идеально дополняющие друг друга нити будут легко связываться друг с другом. Чтобы уменьшить разнообразие и получить наиболее энергетически предпочтительные комплексы, метод, называемый отжиг используется в лабораторной практике. Однако из-за различной молекулярной геометрии нуклеотидов единственное несоответствие между двумя цепями сделает связывание между ними менее энергетически выгодным. Измерение эффектов несовместимости оснований путем количественной оценки температуры, при которой отжигаются две нити, может предоставить информацию о сходстве в последовательности оснований между двумя отжигаемыми цепями. Комплексы могут быть диссоциированы термическим денатурация, также называемый плавлением. При отсутствии внешних негативных факторов процессы гибридизации и плавления могут повторяться подряд до бесконечности, что создает основу для полимеразной цепной реакции. Чаще всего образуются пары нуклеиновых оснований A = T и G≡C, из которых последнее более стабильно.

Денатурация

Денатурация ДНК, также называемая плавлением ДНК, представляет собой процесс, при котором двухцепочечные дезоксирибонуклеиновая кислота разматывается и разделяется на одноцепочечные нити за счет разрыва гидрофобный укладка аттракционов между базами. Видеть Гидрофобный эффект. Оба термина используются для обозначения процесса, который происходит при нагревании смеси, хотя «денатурация» также может относиться к разделению цепей ДНК, вызванному такими химическими веществами, как формамид или же мочевина.[1]

Процесс денатурации ДНК можно использовать для анализа некоторых аспектов ДНК. Поскольку пары оснований цитозина / гуанина обычно сильнее, чем пары оснований аденина / тимина, количество цитозина и гуанина в геноме (называемое "Содержимое GC ") можно оценить путем измерения температуры плавления геномной ДНК.[2] Более высокие температуры связаны с высоким содержанием GC.

Денатурацию ДНК также можно использовать для обнаружения различий в последовательностях между двумя разными последовательностями ДНК. ДНК нагревают и денатурируют в одноцепочечное состояние, а смесь охлаждают, чтобы позволить цепям повторно гибридизоваться. Гибридные молекулы образуются между похожими последовательностями, и любые различия между этими последовательностями приведут к нарушению спаривания оснований. В геномном масштабе этот метод использовался исследователями для оценки генетическая дистанция между двумя видами, процесс, известный как ДНК-ДНК гибридизация.[3] В контексте единственной изолированной области ДНК, денатурирующие гели градиента и гели температурного градиента могут быть использованы для обнаружения наличия небольших несоответствий между двумя последовательностями, процесс, известный как гель-электрофорез в градиенте температуры.[4][5]

Методы анализа ДНК, основанные на температуре плавления, имеют недостаток в том, что они являются прокси для изучения лежащей в основе последовательности; Секвенирование ДНК обычно считается более точным методом.

Процесс плавления ДНК также используется в методах молекулярной биологии, особенно в полимеразной цепной реакции. Хотя температура плавления ДНК не является диагностической в ​​методике, методы оценки Тм важны для определения подходящей температуры для использования в протоколе. Температуры плавления ДНК также могут использоваться в качестве показателя для выравнивания сил гибридизации набора молекул, например олигонуклеотидные зонды ДНК-микрочипы.

Отжиг

Отжиг, в генетика, средства для комплементарные последовательности одноцепочечных ДНК или же РНК спариваться водородные связи образовывать двухцепочечный полинуклеотид. Перед отжигом одну из нитей может потребоваться фосфорилированный ферментом, таким как киназа чтобы обеспечить правильное водородное связывание. Термин отжиг часто используется для описания связывания ДНК-зонд, или привязка грунтовка к цепи ДНК во время полимеразной цепной реакции. Этот термин также часто используется для описания реформации (ренатурация ) обратно-комплементарных нитей, которые были разделены нагреванием (термически денатурированы). Белки, такие как RAD52 может помочь отжигу ДНК. ДНК отжиг прядей является ключевым этапом на пути гомологичная рекомбинация. В частности, во время мейоз, отжиг прядей, зависящий от синтеза является основным путем гомологичной рекомбинации.

Штабелирование

Стабильность при плавлении стопок пар оснований (B ДНК)[6]
ШагПлавление ΔG °37
(Ккал / моль)
Т А-0.12
T G или же C A-0.78
C G-1.44
А G или же C T-1.29
А А или же Т Т-1.04
В-1.27
G A или же Т С-1.66
С С или же G G-1.97
А С или же G T-2.04
G C-2.70

Укладка - это стабилизирующее взаимодействие между плоскими поверхностями соседних оснований. Сложение может происходить с любой гранью основания, то есть 5'-5 ', 3'-3' и наоборот.[7]

Накопление "свободных" молекул нуклеиновой кислоты в основном обеспечивается межмолекулярная сила, в частности, электростатическое притяжение между ароматическими кольцами, процесс, также известный как пи стекинг. Для биологических систем с водой в качестве растворителя: гидрофобный эффект способствует и помогает в формировании спирали.[8] Укладка - главный стабилизирующий фактор двойной спирали ДНК.[9]

Вклад стэкинга в свободную энергию молекулы можно экспериментально оценить, наблюдая равновесие изогнутого стэка в порезанная ДНК. Такая стабилизация зависит от последовательности.[6] Степень стабилизации зависит от концентрации соли и температуры.[9]

Термодинамика модели двух состояний

Для расчета используются несколько формул Тм значения.[10][11] Некоторые формулы более точны при прогнозировании температуры плавления дуплексов ДНК.[12] Для олигонуклеотидов ДНК, то есть коротких последовательностей ДНК, термодинамика гибридизации может быть точно описана как процесс с двумя состояниями. В этом приближении можно пренебречь возможностью промежуточных состояний частичного связывания при образовании двухцепочечного состояния из двух одноцепочечных олигонуклеотидов. Исходя из этого предположения, можно элегантно описать термодинамические параметры для образования двухцепочечной нуклеиновой кислоты AB из одноцепочечных нуклеиновых кислот A и B.

AB ↔ A + B

Константа равновесия для этой реакции равна . Согласно уравнению Вант-Гоффа, соотношение между свободной энергией Δграмм, и K есть ΔG ° = -RTпер K, куда р - постоянная закона идеального газа, и Т - температура реакции по Кельвину. Это дает для системы нуклеиновых кислот

.

Температура плавления, Тм, возникает, когда диссоциировала половина двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Если дополнительных нуклеиновых кислот нет, то [A], [B] и [AB] будут равны и равны половине исходной концентрации двухцепочечной нуклеиновой кислоты, [AB]исходный. Это дает выражение для температуры плавления дуплекса нуклеиновой кислоты

.

Поскольку Δграмм° = ΔЧАС° -ТΔS°, Тм также дается

.

Члены ΔЧАС° и ΔS° обычно даются для ассоциации, а не для реакции диссоциации (см., Например, метод ближайшего соседа). Затем эта формула превращается в:[13]

, где [B]общий <[A]общий.

Как уже упоминалось, это уравнение основано на предположении, что в плавлении участвуют только два состояния: двухцепочечное состояние и состояние случайной катушки. Однако нуклеиновые кислоты могут плавиться через несколько промежуточных состояний. Чтобы учесть такое сложное поведение, методы статистическая механика необходимо использовать, что особенно актуально для длинных последовательностей.

Оценка термодинамических свойств по последовательности нуклеиновой кислоты

В предыдущем абзаце показано, как температура плавления и термодинамические параметры (Δграмм° или ΔЧАС° и ΔS°) связаны друг с другом. Наблюдая за температурами плавления, можно экспериментально определить термодинамические параметры. И наоборот, что важно для приложений, когда термодинамические параметры данной последовательности нуклеиновой кислоты известны, температура плавления может быть предсказана. Оказывается, для олигонуклеотидов эти параметры могут быть хорошо аппроксимированы моделью ближайшего соседа.

Метод ближайшего соседа

Взаимодействие между основаниями на разных нитях в некоторой степени зависит от соседних оснований. Вместо того, чтобы рассматривать спираль ДНК как последовательность взаимодействий между парами оснований, модель ближайшего соседа рассматривает спираль ДНК как последовательность взаимодействий между «соседними» парами оснований.[13] Так, например, показанная ниже ДНК имеет взаимодействия ближайших соседей, обозначенных стрелками.

    ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
5 'К-Г-Т-Т-Г-А 3'
3 'G-C-A-A-C-T 5'

Свободная энергия образования этой ДНК из отдельных цепей Δграмм°, представлен (при 37 ° C) как

Δграмм°37(прогноз) = Δграмм°37(Инициирование C / G) + Δграмм°37(CG / GC) + Δграмм°37(GT / CA) + Δграмм°37(TT / AA) + Δграмм°37(ТГ / АС) + Δграмм°37(GA / CT) + Δграмм°37(Запуск A / T)

За исключением члена инициирования C / G, первый член представляет свободную энергию первой пары оснований, CG, в отсутствие ближайшего соседа. Второй член включает как свободную энергию образования второй пары оснований, GC, так и стэкинг-взаимодействие между этой парой оснований и предыдущей парой оснований. Остальные термины определяются аналогично. В общем, свободная энергия образования дуплекса нуклеиновой кислоты равна

,

куда представляет собой свободную энергию, связанную с одной из десяти возможных пар нуклеотидов ближайших соседей, и представляет его количество в последовательности.

Каждый Δграмм° терм имеет энтальпию, ΔЧАС° и энтропийное ΔS°, параметры, поэтому изменение свободной энергии также определяется выражением

.

Значения ΔЧАС° и ΔS° были определены для десяти возможных пар взаимодействий. Они приведены в таблице 1 вместе со значением Δграмм° рассчитано при 37 ° C. Используя эти значения, значение Δграмм37° для показанного выше дуплекса ДНК составляет -22,4 кДж / моль. Экспериментальное значение -21,8 кДж / моль.

Таблица 1. Параметры ближайшего соседа для дуплексов ДНК / ДНК в 1 М NaCl.[13]
Последовательность ближайшего соседа
(5'-3'/3'-5')		°
кДж / моль		°
Дж / (моль · К)		°37
кДж / моль
AA / TT−33.1−92.9−4.26
AT / TA−30.1−85.4−3.67
TA / AT−30.1−89.1−2.50
CA / GT−35.6−95.0−6.12
GT / CA−35.1−93.7−6.09
CT / GA−32.6−87.9−5.40
GA / CT−34.3−92.9−5.51
CG / GC−44.4−113.8−9.07
GC / CG−41.0−102.1−9.36
GG / CC−33.5−83.3−7.66
Клемма A / T базовая пара9.617.24.31
Клемма G / C базовая пара0.4−11.74.05

Параметры, связанные с десятью группами соседей, показанными в таблице 1, определяют по температурам плавления коротких олигонуклеотидных дуплексов. Любопытно, что только восемь из десяти групп независимы.

Модель ближайшего соседа может быть расширена за пределы пар Уотсона-Крика, чтобы включить параметры для взаимодействий между несовпадениями и соседними парами оснований.[14] Это позволяет оценивать термодинамические параметры последовательностей, содержащих изолированные несовпадения, такие как, например, (стрелки указывают на несовпадение)

          ↓↓↓
5 'G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3 'К-К-Т-Г-Г-К-Т-Г-К 5'

Эти параметры были подобраны на основе экспериментов по плавлению, и расширение таблицы 1, которая включает несоответствия, можно найти в литературе.

Более реалистичным способом моделирования поведения нуклеиновых кислот может быть использование параметров, которые зависят от соседних групп по обе стороны от нуклеотида, что дает таблицу с записями типа «TCG / AGC». Однако это будет включать около 32 групп для пар Уотсона-Крика и даже больше для последовательностей, содержащих несовпадения; Количество экспериментов по плавлению ДНК, необходимых для получения надежных данных для такого большого количества групп, было бы слишком большим. Однако существуют и другие средства для доступа к термодинамическим параметрам нуклеиновых кислот: технология микроматриц позволяет проводить гибридизационный мониторинг десятков тысяч последовательностей параллельно. Эти данные в сочетании с теорией молекулярной адсорбции позволяют определять многие термодинамические параметры в одном эксперименте.[15] и выйти за рамки модели ближайшего соседа.[16] В целом предсказания метода ближайшего соседа достаточно хорошо согласуются с экспериментальными результатами, но некоторые неожиданные отдаленные последовательности, требующие дальнейшего понимания, действительно существуют.[16] Наконец, мы должны также упомянуть повышенную точность, обеспечиваемую анализами разархивирования одной молекулы, которые позволяют по-новому взглянуть на термодинамику гибридизации ДНК, а также на достоверность модели ближайшего соседа.[17]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Диван, Ройдс (2013). Инструменты и методы в биомолекулярной науке. Издательство Оксфордского университета. п. 243.
  2. ^ М. Мандель; Дж. Мармур (1968). Использование профиля поглощения ультрафиолетового излучения и температуры для определения содержания гуанина и цитозина в ДНК. Методы в энзимологии. 12. стр.198–206. Дои:10.1016/0076-6879(67)12133-2. ISBN  978-0-12-181856-2.
  3. ^ К.Г. Сибли; Дж. Э. Алквист (1984). «Филогения гоминоидных приматов, как показано гибридизацией ДНК-ДНК». Журнал молекулярной эволюции. 20 (1): 2–15. Bibcode:1984JMolE..20 .... 2S. Дои:10.1007 / BF02101980. PMID  6429338.
  4. ^ Р.М. Майерс; Т. Маниатис; Л.С. Лерман (1987). Обнаружение и локализация изменений отдельных оснований с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Методы в энзимологии. 155. стр.501–527. Дои:10.1016/0076-6879(87)55033-9. ISBN  978-0-12-182056-5. PMID  3431470.
  5. ^ Т. По; Г. Стегер; В. Розенбаум; Дж. Капер; Д. Риснер (1987). «Двухцепочечная РНК, ассоциированная с кукумовирусом 5: экспериментальный анализ некрогенных и ненекрогенных вариантов с помощью гель-электрофореза в градиенте температуры». Исследования нуклеиновых кислот. 15 (13): 5069–5083. Дои:10.1093 / nar / 15.13.5069. ЧВК  305948. PMID  3601667.
  6. ^ а б Протозанова Е., Яковчук П., Франк-Каменецкий М.Д. (2004). «Сложенное – несложное равновесие в месте расположения ДНК». Дж Мол Биол. 342 (3): 775–785. Дои:10.1016 / j.jmb.2004.07.075. PMID  15342236.
  7. ^ "Определение терминов". База данных нуклеиновых кислот. Получено 4 апреля 2019.
  8. ^ Спонер, Дж; Спонер, JE; Младек, А; Юречка, П; Banáš, P; Отепка, М. (декабрь 2013). «Природа и величина укладки ароматических оснований в ДНК и РНК: квантовая химия, молекулярная механика и эксперимент». Биополимеры. 99 (12): 978–88. Дои:10.1002 / bip.22322. PMID  23784745.
  9. ^ а б Яковчук, П; Протозанова, Э; Франк-Каменецкий, М.Д. (2006). «Вклады укладки оснований и спаривания оснований в термическую стабильность двойной спирали ДНК». Исследования нуклеиновых кислот. 34 (2): 564–74. Дои:10.1093 / нар / gkj454. ЧВК  1360284. PMID  16449200.
  10. ^ Breslauer, K.J .; Франк, Р.; Blöcker, H; Марки, Луизиана; и другие. (1986). «Прогнозирование стабильности дуплекса ДНК по базовой последовательности». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 83 (11): 3746–3750. Bibcode:1986PNAS ... 83.3746B. Дои:10.1073 / pnas.83.11.3746. ЧВК  323600. PMID  3459152. (pdf)[постоянная мертвая ссылка ]
  11. ^ Rychlik, W .; Спенсер, В. Дж .; Роадс, Р. Э. (1990). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro». Нуклеиновые кислоты Res. 18 (21): 6409–6412. Дои:10.1093 / nar / 18.21.6409. ЧВК  332522. PMID  2243783.
  12. ^ Owczarzy R .; Валлоне П.М.; Gallo F.J .; Панер Т.М .; Lane M.J .; Benight A.S (1997). «Прогнозирование зависимой от последовательности стабильности плавления коротких дуплексных олигомеров ДНК». Биополимеры. 44 (3): 217–239. Дои:10.1002 / (SICI) 1097-0282 (1997) 44: 3 <217 :: AID-BIP3> 3.0.CO; 2-Y. PMID  9591477. (pdf)
  13. ^ а б c Джон Санта-Люсия-младший (1998). «Единый взгляд на термодинамику ближайших соседей полимерной, гантелевой и олигонуклеотидной ДНК». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 95 (4): 1460–5. Bibcode:1998PNAS ... 95.1460S. Дои:10.1073 / pnas.95.4.1460. ЧВК  19045. PMID  9465037.
  14. ^ Джон Санта-Люсия-младший, Джон; Дональд Хикс (июнь 2004 г.). «Термодинамика структурных мотивов ДНК». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул. 33: 415–440. Дои:10.1146 / annurev.biophys.32.110601.141800. PMID  15139820.
  15. ^ Hooyberghs, J .; Van Hummelen, P .; Карлон, Э. (2009). «Влияние несовпадений на гибридизацию в ДНК-микрочипах: определение параметров ближайшего соседа». Исследования нуклеиновых кислот. 37 (7): e53. Дои:10.1093 / nar / gkp109. ЧВК  2673445. PMID  19270064.
  16. ^ а б Hadiwikarta, W. W .; Walter, J.C .; Hooyberghs, J .; Карлон, Э. (2012). «Исследование параметров гибридизации из экспериментов с микрочипами: модель ближайшего соседа и за ее пределами». Исследования нуклеиновых кислот. 40 (18): e138. arXiv:1211.1303. Дои:10.1093 / нар / гкс475. ЧВК  3467032. PMID  22661582.
  17. ^ Huguet, J.M .; Bizarro, C.V .; Forns, N .; Smith, S. B .; Bustamante, C .; Риторт, Ф. (2010). «Одномолекулярное происхождение зависимых от соли свободных энергий пары оснований в ДНК». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 107 (35): 15431–6. arXiv:1010.1188. Bibcode:2010PNAS..10715431H. Дои:10.1073 / pnas.1001454107. ЧВК  2932562. PMID  20716688.

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Гибридизация нуклеиновых кислот