Аспартат карбамоилтрансфераза - Aspartate carbamoyltransferase

Аспартат карбамоилтрансфераза
Апартат-карбамоилтрансфераза-pdb-2ATC.png
Аспартат карбамоилтрансфераза из кишечная палочка. PDB 2ATC.
Идентификаторы
Номер ЕС2.1.3.2
Количество CAS9012-49-1
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
БРЕНДАBRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmiGO / QuickGO
Карбамоилфосфатсинтетаза 2 человека, аспартат-транскарбамоилаза, дигидрооротаза
Идентификаторы
СимволCAD
Ген NCBI790
HGNC1424
OMIM114010
RefSeqNM_004341
UniProtP27708
Прочие данные
Номер ЕС2.1.3.2
LocusChr. 2 p22-p21

Аспартат карбамоилтрансфераза (также известен как аспартат-транскарбамоилаза или ATCase) катализирует первый шаг в путь биосинтеза пиримидина (ЕС 2.1.3.2 ).[1]

В Кишечная палочка, фермент является мульти-подразделение белок комплекс, состоящий из 12 субъединиц (всего 300 кДа).[2] Состав субъединиц - C6р6, образуя 2 тримеры каталитических субъединиц (34 кДа) и 3 димеры регуляторных субъединиц (17 кДа). Особое расположение каталитических и регуляторных субъединиц в этом ферменте дает комплекс с сильным аллостерический поведение по отношению к его субстратам.[3] Фермент является типичным примером аллостерической модуляции тонкого контроля метаболических ферментативных реакций.

ATCase не следует Кинетика Михаэлиса – Ментен. Напротив, он находится между его «напряженным» с низкой активностью и низким сродством и его «расслабленным» состоянием с высокой активностью и высоким сродством.[4] Связывание субстрата с каталитическими субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону R-состояния, тогда как связывание ОСАГО к регуляторным субъединицам приводит к смещению равновесия в сторону Т-состояния. Связывание АТФ с регуляторными субъединицами приводит к смещению равновесия в сторону R-состояния.[5]

Реакция

ATCase - это строго регулируемый фермент, который катализирует первую коммитируемую стадию биосинтеза пиримидина, конденсацию l-аспартат и карбамоилфосфат формировать N-карбамил-L-аспартат и неорганический фосфат. Катализ с помощью ATCase служит этапом, ограничивающим скорость биосинтеза пиримидина, поскольку он изменяет его каталитическую скорость в ответ на клеточные уровни обоих пиримидины и пурины. Конечный продукт пиримидинового пути, ОСАГО, снижает каталитическую скорость, тогда как АТФ, конечный продукт параллельного пуринового пути, увеличивает каталитическую скорость.

Реакция аспартат-транскарбамилазы.

Структура

Схематическая диаграмма структуры ATCase, изображающая пространственное расположение зеленых регуляторных (R) и синих каталитических (C) субъединиц. Перерисовано и изменено из Ke и другие., 1984.[6]

Дальнейшее обсуждение структуры, каталитического центра и аллостерического сайта основано на прокариотической версии ATCase, в частности Кишечная палочка 'с.

Ранние исследования показали, что ATCase состоит из двух разных типов полипептид цепочки, которые выполняют разные роли.[7] Каталитические субъединицы катализируют карбамилирование амино- группа аспартат но не обладают регуляторными свойствами, а регуляторные субъединицы не обладают какой-либо каталитической активностью, но содержат регулирующие сайты для связывания эффектора. ATCase холоэнзим состоит из двух каталитических тримеров, которые находятся в контакте и удерживаются вместе тремя регуляторными димерами, поэтому нативная форма фермента содержит шесть цепей каждого типа, с общим молекулярный вес из 310 кДа.

Каждый из каталитических доменов состоит из двух структурных доменов, аспартатного домена, который содержит большинство остатков, ответственных за связывание аспартат, и карбамоилфосфатный домен, который содержит большинство остатков, которые связываются с карбамоилфосфат. Каждый регуляторный домен также состоит из двух доменов, аллостерического домена, который имеет сайт связывания для нуклеотида. эффекторы, а цинк домен, состоящий из четырех цистеин остатки сгруппированы в его C-концевом районе. Эти остатки координировать а цинк атом это не участвует в каком-либо каталитическом свойстве, но, как было показано, важно для ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц.[8]

Трехмерное расположение каталитических и регуляторных субъединиц включает несколько ионный и гидрофобный стабилизация контактов между аминокислотными остатками.[6] Каждая каталитическая цепь находится в контакте с тремя другими каталитическими цепями и двумя регуляторными цепями. Каждый регуляторный мономер находится в контакте с одной другой регуляторной цепью и двумя каталитическими цепями. В несвязанном ферменте два каталитических тримера также находятся в контакте.

Каталитический центр

Каталитический сайт ATCase расположен на границе между двумя соседними каталитическими цепями в одном и том же тримере и включает боковые цепи аминокислот из обеих этих субъединиц. Понимание способа связывания субстратов с каталитическим центром ATCase впервые стало возможным благодаря связыванию аналога бисубстрата, N- (фосфоноацетил) -L-аспартата (PALA).[9] Это соединение является сильным ингибитором ATCase и имеет структуру, которая, как полагают, очень близка к структуре переходное состояние подложек.[10] Кроме того, были получены кристаллические структуры ATCase, связанной с карбамоилфосфатом и сукцинатом.[11] Эти исследования, в дополнение к исследованиям с использованием сайт-направленного мутагенеза конкретных аминокислот, идентифицировали несколько остатков, которые имеют решающее значение для катализа, таких как Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231 и Ser80 и Lys84 из соседней каталитической цепи. Активный сайт - это сильно заряженный карман. Одна из наиболее важных боковых цепей происходит из Arg54, который взаимодействует с концевым кислородом и кислородом ангидрида карбамоилфосфата, стабилизируя отрицательный заряд уходящей фосфатной группы. Arg105, His134 и Thr55 помогают увеличить электрофильность карбонильного углерода за счет взаимодействия с карбонильным кислородом.[7] В общем, увеличение скорости ATCase достигается за счет ориентации и стабилизации субстратов, промежуточных продуктов и продуктов, а не за счет прямого участия аминокислотных остатков в каталитическом механизме.

Аллостерический сайт

Аллостерический сайт в аллостерическом домене R-цепей комплекса ATCase связывается с нуклеотидами АТФ, CTP и / или UTP. В каждом регуляторном димере есть один сайт с высоким сродством к АТФ и CTP и один с 10-20 раз меньшим сродством к этим нуклеотидам.[7] АТФ связывается преимущественно с сайтами с высоким сродством и впоследствии активирует фермент, в то время как связывание УТФ и ЦТФ приводит к ингибированию активности. UTP может связываться с аллостерическим сайтом, но ингибирование ATCase с помощью UTP возможно только в сочетании с CTP. При наличии CTP связывание UTP усиливается и предпочтительно направляется на сайты с низким сродством. Напротив, связывание UTP приводит к увеличению сродства к CTP на сайтах с высоким сродством, и вместе они ингибируют активность фермента до 95%, в то время как связывание CTP само по себе ингибирует активность до 50-70%.[3]Сравнение кристаллических структур T- и R-форм ATCase показывает, что она увеличивается в размерах во время аллостерического перехода и что каталитические субъединицы конденсируются во время этого процесса. Два каталитических тримера раздвигаются вдоль оси третьего порядка на 12 Å, и они вращаются вокруг этой оси на 5 ° каждый, что в конечном итоге приводит к переориентации регуляторных субъединиц вокруг своей оси второго порядка на 15 °.[12] Этот четвертичная структура изменение связано с изменениями межсубъединичных и междоменных взаимодействий. Взаимодействие между субъединицами C1-C4 и R1 во время этого преобразования сильно модифицируется. В частности, наблюдается большое перемещение аминокислотных остатков 230-254, известных под общим названием 240s петля. Эти остатки расположены в щели между карбамоилфосфат и аспартат домены на интерфейсе C1-C4. Общий результат этих структурных изменений состоит в том, что два домена каждой каталитической цепи сближаются, обеспечивая лучший контакт с субстраты или их аналоги.

Во время этого структурного перехода некоторые взаимодействия между боковыми цепями теряются, а некоторые другие устанавливаются. Исследования подтвердили, что положение петли 240s напрямую влияет на связывание субстрата в соответствующем активном сайте.[13] Более ранние исследования с использованием сайт-направленного мутагенеза 240s петли показали, что взаимодействия между Asp271 и Tyr240, а также между Glu239 из C1 и Tyr165 из C4 стабилизируют Т-состояние, в то время как взаимодействия между Glu239 из C1 и Lys164 и Tyr165 из C4 стабилизируют R-состояние.[14]

Расположенная близко к 240s петле и активному сайту, область петли, охватывающая остатки 160–166, играет роль как во внутренней архитектуре фермента, так и в его регуляторных свойствах.[15] В частности, остаток Asp162 взаимодействует с Gln231 (известно, что он участвует в связывании аспартата) и связывает одни и те же остатки как в T, так и в R-состояниях. Мутант, у которого этот остаток мутировал до аланин показали огромное снижение удельной активности, двукратное снижение сродства к аспартат, потеря гомотропной кооперативности и снижение активации за счет АТФ. Было высказано предположение, что изменение общей структуры, вызванное введением этого остатка, влияет на другие остатки в интерфейсах R1-C1, R1-C4 и C1-C4, которые участвуют в четвертичная структура переход.[16]

Монтаж комплекса

Регуляторные и каталитические субъединицы существуют как гомологи слитых белков, что дает убедительные доказательства того, что они будут взаимодействовать друг с другом.[17] Два каталитических тримера и два регуляторных димера собираются с образованием промежуточного соединения аспартат-карбамоилтрансферазы, состоящего из 6 каталитических субъединиц и 4 регуляторных субъединиц.[18]

Рекомендации

  1. ^ Simmer JP, Kelly RE, Rinker AG, Zimmermann BH, Scully JL, Kim H, Evans DR (январь 1990 г.). «Дигидрооротаза млекопитающих: нуклеотидная последовательность, пептидные последовательности и эволюция дигидрооротазного домена многофункционального белка CAD». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 87 (1): 174–8. Дои:10.1073 / pnas.87.1.174. ЧВК  53223. PMID  1967494.
  2. ^ Macol CP, Tsuruta H, Stec B, Kantrowitz ER (май 2001 г.). «Прямые структурные доказательства согласованного аллостерического перехода в аспартат-транскарбамоилазе Escherichia coli». Структурная биология природы. 8 (5): 423–6. Дои:10.1038/87582. PMID  11323717. S2CID  35403933.
  3. ^ а б Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (сентябрь 2001 г.). «Аллостерическая регуляция каталитической активности: аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli по сравнению с хризматмутазой дрожжей». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии. 65 (3): 404–21, содержание. Дои:10.1128 / MMBR.65.3.404-421.2001. ЧВК  99034. PMID  11528003.
  4. ^ Биохимия, Кэмпбелл и Фаррел, глава 7
  5. ^ Альбертс, Брюс, автор. Молекулярная биология клетки. ISBN  978-1-315-73536-8. OCLC  1082214404.CS1 maint: несколько имен: список авторов (ссылка на сайт)
  6. ^ а б Ke HM, Honzatko RB, Lipscomb WN (июль 1984 г.). "Структура нелигированной аспартат карбамоилтрансферазы кишечная палочка при разрешении 2,6 Å ». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 81 (13): 4037–40. Дои:10.1073 / pnas.81.13.4037. ЧВК  345363. PMID  6377306.
  7. ^ а б c Липскомб WN (1994). «Аспартат-транскарбамилаза из Escherichia coli: активность и регуляция». Достижения в энзимологии и смежных областях молекулярной биологии. Достижения в энзимологии и смежных областях молекулярной биологии. 68. С. 67–151. Дои:10.1002 / 9780470123140.ch3. ISBN  9780470123140. PMID  8154326.
  8. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (август 1988 г.). «Аспартат-транскарбамилаза Escherichia coli: взаимосвязь между структурой и функцией». Наука. 241 (4866): 669–74. Дои:10.1126 / science.3041592. PMID  3041592.
  9. ^ Краузе К.Л., Фольц К.В., Липскомб В.Н. (февраль 1987 г.). «2.5. Структура аспартаткарбамоилтрансферазы в комплексе с бисубстратным аналогом N- (фосфонацетил) -L-аспартатом». Журнал молекулярной биологии. 193 (3): 527–53. Дои:10.1016/0022-2836(87)90265-8. PMID  3586030.
  10. ^ Ван Дж., Штиглиц К.А., Кардиа Дж. П., Кантровиц Е.Р. (июнь 2005 г.). «Структурная основа для упорядоченного связывания субстрата и кооперативности в аспартат-транскарбамоилазе». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 102 (25): 8881–6. Дои:10.1073 / pnas.0503742102. ЧВК  1157055. PMID  15951418.
  11. ^ Гуо Дж. Э., Липскомб В. Н. (июнь 1988 г.). «Трехмерная структура карбамоилфосфата и сукцината, связанных с аспартат-карбамоилтрансферазой». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 85 (12): 4205–8. Дои:10.1073 / пнас.85.12.4205. ЧВК  280395. PMID  3380787.
  12. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (февраль 1990 г.). «Аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli: молекулярная основа согласованного аллостерического перехода». Тенденции в биохимических науках. 15 (2): 53–9. Дои:10.1016 / 0968-0004 (90) 90176-С. PMID  2186515.
  13. ^ Фетлер Л., Вашетт П., Эрве Г., Ладжими М.М. (декабрь 1995 г.). «В отличие от перехода четвертичной структуры, изменение третичной структуры 240s петли в аллостерической аспартаттранскарбамилазе требует для завершения насыщения активного сайта субстратом». Биохимия. 34 (48): 15654–60. Дои:10.1021 / bi00048a008. PMID  7495794.
  14. ^ Миддлтон С.А., Кантровиц Е.Р. (август 1986 г.). «Важность петли на остатках 230–245 в аллостерических взаимодействиях аспартат карбамоилтрансферазы Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 83 (16): 5866–70. Дои:10.1073 / пнас.83.16.5866. ЧВК  386397. PMID  3526342.
  15. ^ Ньютон С.Дж., Стивенс Р.К., Кантровиц Е.Р. (март 1992 г.). «Важность консервативного остатка аспартата-162 для функции аспартат-транскарбамоилазы Escherichia coli». Биохимия. 31 (11): 3026–32. Дои:10.1021 / bi00126a026. PMID  1550826.
  16. ^ Fetler L, Tauc P, Baker DP, Macol CP, Kantrowitz ER, Vachette P (май 2002 г.). «Замена Asp-162 на Ala предотвращает кооперативный переход субстратов при одновременном усилении эффекта аллостерического активатора АТФ на аспартат-транскарбамоилазу E. coli». Белковая наука. 11 (5): 1074–81. Дои:10.1110 / л.с. 4500102. ЧВК  2373563. PMID  11967364.
  17. ^ Marsh JA, Hernández H, Hall Z, Ahnert SE, Perica T, Robinson CV, Teichmann SA (апрель 2013 г.). «Белковые комплексы подвергаются эволюционному отбору для сборки упорядоченными путями». Клетка. 153 (2): 461–470. Дои:10.1016 / j.cell.2013.02.044. ЧВК  4009401. PMID  23582331.
  18. ^ Эванс Д. Р., Пастра-Ландис С. К., Липскомб В. Н. (апрель 1974 г.). «Промежуточный комплекс при диссоциации аспартат-транскарбамилазы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 71 (4): 1351–5. Дои:10.1073 / pnas.71.4.1351. ЧВК  388226. PMID  4598300.

внешняя ссылка