Короткая шпилька РНК - Short hairpin RNA

Лентивирус доставка shRNA и механизм РНК-интерференции в клетках млекопитающих.

А короткая шпилька РНК или же маленькая шпилька РНК (shRNA/ Шпилька Вектор) - это искусственный РНК молекула с крутым поворотом шпильки, которая может быть использована для подавления экспрессии целевого гена через РНК-интерференция (РНКи).[1][2] Выражение shRNA в клетках обычно осуществляется путем доставки плазмиды или через вирусные или бактериальные векторов. shRNA является выгодным медиатором РНКи, поскольку она имеет относительно низкую скорость деградации и оборота. Однако это требует использования вектор выражения, который может вызывать побочные эффекты при применении в медицине.[3]

В промоутер выбор важен для достижения устойчивой экспрессии shRNA. Во-первых, полимераза III использовали промоторы, такие как U6 и H1; однако эти промоторы лишены пространственного и временного контроля.[3] Таким образом, произошел переход к использованию полимераза II промоторы для регуляции экспрессии shRNA.

Доставка

Экспрессию shRNA в клетках можно получить путем доставки плазмиды или через вирусные или бактериальные векторов.

Доставка плазмид в клетки посредством трансфекции для получения экспрессии shРНК может осуществляться с использованием коммерчески доступных реагентов. in vitro. Однако этот метод не применим in vivo и поэтому имеет ограниченную полезность.

Использование бактериального вектора для получения экспрессии shРНК в клетках - относительно недавний подход. Он основан на исследованиях, показывающих, что рекомбинантный кишечная палочка, содержащий плазмиду с shRNA, скармливаемую мышам, может подавлять экспрессию целевого гена в эпителии кишечника.[4] Этот подход использовался в 2012 году в клинических испытаниях, направленных на лечение пациентов с семейным аденоматозным полипозом.[5]

Для получения экспрессии кшРНК в клетках можно использовать различные вирусные векторы, включая аденоассоциированные вирусы (AAV), аденовирусы, и лентивирусы. У аденоассоциированных вирусов и аденовирусов геномы остаются эписомальными. Это выгодно, так как избегается инсерционный мутагенез. Его недостаток состоит в том, что потомство клетки будет быстро терять вирус в результате деления клетки, если клетка не делится очень медленно. AAV отличаются от аденовирусов тем, что вирусные гены удалены, и они имеют пониженную упаковочную способность. Лентивирусы интегрируются в участки транскрипционно активного хроматина и, таким образом, передаются клеткам потомства. При таком подходе повышается риск инсерционного мутагенеза; однако риск можно снизить, используя лентивирус с дефицитом интегразы.[6]

В dicer белок из Лямблии кишечные.[7]

Механизм действия

Как только вектор интегрирован в геном хозяина, кшРНК затем транскрибируется в ядре полимеразой II или полимеразой III в зависимости от выбора промотора. Продукт имитирует pri-microRNA (pri-miRNA) и обрабатывается Дроша. Полученная пре-shРНК экспортируется из ядра с помощью Exportin 5. Этот продукт затем обрабатывается Дайсер и загружен в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC). Смысловая (пассажирская) нить деградирует. Антисмысловая (направляющая) цепь направляет RISC к мРНК, которая имеет комплементарную последовательность. В случае идеальной комплементарности RISC расщепляет мРНК. В случае несовершенной комплементарности RISC подавляет трансляцию мРНК. В обоих случаях shРНК приводит к молчанию гена-мишени.

Применение в генной терапии

Из-за способности shRNA обеспечивать специфическое, продолжительное, молчание генов, существует большой интерес к использованию shRNA для приложений генной терапии. Ниже обсуждаются три примера терапии на основе shRNA.

Компания Gradalis, Inc. разработала вакцину FANG, которая используется для лечения запущенных форм рака. FANG полагается на бифункциональную shRNA (bi-shRNA) против иммуносупрессивных трансформирующих факторов роста (TGF) β1 и β2.[8] У пациентов собирали аутологичные опухолевые клетки и вводили плазмиду, кодирующую бифункциональную shРНК и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GMCSF). ex vivo посредством электропорации. Эти клетки позже были облучены и снова введены пациенту.

Марина Биотек разработала CEQ508, который используется для лечения семейного аденоматозного полипоза. CEQ508 использует бактериальный вектор для доставки shРНК против β-катенина.

Компания Gradalis, Inc. разработала бифункциональную shRNA-STMN1 (pbi-shRNA STMN1), которая используется для лечения запущенных и / или метастатических форм рака. Эта pbi-shRNA STMN1 действует против статмина 1 и доставляется внутри опухоли через липоплекс (LP) биламеллярных инвагинированных пузырьков (BIV).

С терапевтическими средствами на основе shRNA обычно сталкиваются несколько проблем. Самая большая проблема - это доставка. shRNA обычно доставляется с использованием вектора, и хотя они обычно эффективны, они создают серьезные проблемы с безопасностью. В частности, подходы генной терапии на основе вирусов оказались опасными в прошлых клинических испытаниях. В первом поколении ретро-вирусной генной терапии некоторые пациенты получали вирусные векторы от Синдром Вискотта – Олдрича развился острый Т-клеточный лейкоз. Было установлено, что это было вызвано местоположением инсерции вирусного вектора.[9] Возможное перенасыщение RISC также является проблемой. Если кшРНК экспрессируется на слишком высоких уровнях, клетка может быть не в состоянии правильно обрабатывать эндогенную РНК, что может вызвать серьезные проблемы. Другой проблемой является возможность того, что у пациента может развиться иммунный ответ против терапии.[10] Наконец, могут быть эффекты нецелевые, и кшРНК может заглушить другие непредусмотренные гены. При разработке успешных новых терапевтических средств на основе shRNA необходимо принимать во внимание все эти проблемы.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Паддисон П.Дж., Кауди А.А., Бернштейн Э., Хэннон Г.Дж., Конклин Д.С. (апрель 2002 г.). «Короткие шпильчатые РНК (кшРНК) индуцируют специфичное для последовательности молчание в клетках млекопитающих». Гены и развитие. 16 (8): 948–58. Дои:10.1101 / gad.981002. ЧВК  152352. PMID  11959843.
  2. ^ Бруммелькамп TR, Бернардс Р, Агами Р. (апрель 2002 г.). «Система стабильной экспрессии коротких интерферирующих РНК в клетках млекопитающих». Наука. 296 (5567): 550–3. Дои:10.1126 / science.1068999. HDL:1874/15573. PMID  11910072.
  3. ^ а б Ван З., Рао Д.Д., Сензер Н., Немунайтис Дж. (Декабрь 2011 г.). «РНК-интерференция и терапия рака». Фармацевтические исследования. 28 (12): 2983–95. Дои:10.1007 / s11095-011-0604-5. PMID  22009588.
  4. ^ Сян С., Фрухауф Дж, Ли Си Джей (июнь 2006 г.). «Бактерии, экспрессирующие РНК с короткой шпилькой, вызывают интерференцию РНК у млекопитающих». Природа Биотехнологии. 24 (6): 697–702. Дои:10.1038 / nbt1211. PMID  16699500.
  5. ^ Бернетт Дж. К., Росси Дж. Дж., Тиманн К. (сентябрь 2011 г.). «Текущий прогресс терапии миРНК / шРНК в клинических испытаниях». Биотехнологический журнал. 6 (9): 1130–46. Дои:10.1002 / biot.201100054. ЧВК  3388104. PMID  21744502.
  6. ^ Ломбардо А., Дженовезе П., Босежур К.М., Коллеони С., Ли Ю.Л., Ким К.А., Андо Д., Урнов Ф.Д., Галли С., Грегори П.Д., Холмс М.С., Налдини Л. (ноябрь 2007 г.). «Редактирование генов в человеческих стволовых клетках с использованием нуклеаз цинковых пальцев и доставки лентивирусных векторов с дефектом интегразы». Природа Биотехнологии. 25 (11): 1298–306. Дои:10.1038 / nbt1353. PMID  17965707.
  7. ^ Макрэ И.Дж., Чжоу К., Ли Ф., Репик А., Брукс А.Н., Канде В.З., Адамс П.Д., Дудна Д.А. (январь 2006 г.). «Структурная основа процессинга двухцепочечной РНК с помощью Dicer». Наука. 311 (5758): 195–8. Дои:10.1126 / science.1121638. PMID  16410517.
  8. ^ Зенцер Н., Барве М., Кун Дж., Мельник А., Бейтч П., Лазар М., Лифшиц С., Маги М., О Дж, Милл С.В., Беделл С., Хиггс К., Кумар П., Ю И, Норвелл Ф., Фалон С., Таке Н. , Рао Д.Д., Ван З., Джей С.М., Паппен Б.О., Валлравен Дж., Бруникарди ФК, Шанахан Д.М., Мэйплс ПБ, Немунайтис Дж. (Март 2012 г.). «Фаза I испытания вакцины« bi-shRNAi (фурин) / ДНК GMCSF / аутологичных опухолевых клеток »(FANG) при запущенном раке». Молекулярная терапия. 20 (3): 679–86. Дои:10.1038 / мт.2011.269. ЧВК  3293620. PMID  22186789.
  9. ^ Лица Д.А., Баум С. (февраль 2011 г.). «Решение проблемы γ-ретровирусных векторов, содержащих длинные концевые повторы». Молекулярная терапия. 19 (2): 229–31. Дои:10.1038 / мт.2010.305. ЧВК  3034864. PMID  21289636.
  10. ^ Уайтхед К.А., Дальман Дж. Э., Лангер Р.С., Андерсон Д.Г. (2011). «Молчание или стимуляция? SiRNA доставки и иммунной системы». Ежегодный обзор химической и биомолекулярной инженерии. 2: 77–96. Дои:10.1146 / annurev-chembioeng-061010-114133. PMID  22432611.