Карбоксипептидаза А - Carboxypeptidase A

Карбоксипептидаза А
Карбоксипептидаза A.png
Карбоксипептидаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скота
Идентификаторы
Номер ЕС3.4.17.1
Количество CAS9031-98-5
Базы данных
IntEnzПросмотр IntEnz
БРЕНДАBRENDA запись
ExPASyПросмотр NiceZyme
КЕГГЗапись в KEGG
MetaCycметаболический путь
ПРИАМпрофиль
PDB структурыRCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтологияAmiGO / QuickGO

Карбоксипептидаза А обычно относится к панкреатический экзопептидаза который гидролизует пептидные связи С-концевых остатков с ароматный или же алифатический боковые цепи. Большинство ученых в этой области теперь называют этот фермент CPA1, и связанной с ним панкреатической карбоксипептидаза так как CPA2.

Типы

Кроме того, есть еще 4 фермента млекопитающих, названные от CPA-3 до CPA-6, и ни один из них не экспрессируется в поджелудочной железе. Вместо этого эти другие ферменты, подобные CPA, выполняют разнообразные функции.

  • CPA3 (также известный как CPA тучных клеток) участвует в переваривании белков посредством тучные клетки.
  • CPA4 (ранее известный как CPA-3, но перенумерованный, когда CPA тучной клетки был обозначен как CPA-3) может участвовать в опухоль прогрессирования, но этот фермент изучен недостаточно.
  • CPA5 изучена недостаточно.
  • CPA6 экспрессируется во многих тканях во время развития мыши, а у взрослых обнаруживает более ограниченное распределение в головном мозге и некоторых других тканях. CPA6 присутствует во внеклеточном матриксе, где он ферментативно активен. Мутация CPA-6 у человека была связана с Синдром Дуэйна (ненормальное движение глаз). Недавно было обнаружено, что мутации в CPA6 связаны с эпилепсией.

Функция

CPA-1 и CPA-2 (и, как предполагается, все другие CPA) используют ион цинка в белке для гидролиза пептидной связи на С-конце аминокислотного остатка. Потеря цинка приводит к потере активности, которую можно легко заменить цинком, а также некоторыми другими двухвалентный металлы (кобальт, никель ). Карбоксипептидаза А вырабатывается в поджелудочной железе и имеет решающее значение для многих процессов в организме человека, включая пищеварение, посттрансляционная модификация белков, свертывания крови и размножения.

Приложения

Такой обширный набор функций для одного белка делает его идеальной моделью для исследований других протеаз цинка неизвестной структуры. Недавние биомедицинские исследования коллагеназы, энкефлиназы и ангиотензинпревращающего фермента использовали карбоксипептидазу А для синтеза ингибитора и кинетических испытаний. Например, препарат для лечения высокого кровяного давления Каптоприл был разработан на основе ингибитора карбоксипептидазы А. Карбоксипептидаза А и целевой фермент каптоприла, ангиотензинпревращающего фермента, имеют очень похожие структуры, поскольку оба они содержат ион цинка в активном центре. Это позволило использовать мощный ингибитор карбоксипептидазы А для ингибирования фермента и, таким образом, снижения артериального давления через систему ренин-ангиотензин-альдостерон.[1]

Структура

Карбоксипептидаза А (CPA) содержит цинк (Zn2+) металлический центр в тетраэдрической геометрии с аминокислотными остатками в непосредственной близости от цинка для облегчения катализа и связывания. Из 307 аминокислот, связанных в пептидной цепи, следующие аминокислотные остатки важны для катализа и связывания; Glu-270, Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145 и Tyr-248. На рис. 1 показан активный центр тетраэдрического цинкового комплекса с важными аминокислотными остатками, которые окружают комплекс.[2]

Металлический цинк представляет собой сильный электрофильный катализатор на основе кислоты Льюиса, который стабилизирует скоординированную молекулу воды, а также стабилизирует отрицательные промежуточные соединения, которые возникают на протяжении гидролитической реакции. Стабилизации как скоординированной молекулы воды, так и отрицательных промежуточных продуктов способствуют полярные остатки в активном центре, которые находятся в непосредственной близости для облегчения водородных связей.[2]

Рисунок 1. Активный сайт CPA

Активный сайт можно разделить на два подсайта, обозначенных как S1’И S1. S1'Субсайт представляет собой гидрофобный карман фермента, а Tyr-248 действует, «закрывая» гидрофобный карман после связывания субстрата или ингибитора (SITE).[2] Водородная связь от гидроксильной группы в Tyr-248 облегчает эту конформацию из-за взаимодействия с концевыми карбоксилатами связывающихся субстратов. Для этого фермента требуется существенное движение, и модель индуцированной подгонки объясняет, как происходит это взаимодействие.

Триада остатков взаимодействуют с C-концевым карбоксилатом через водородную связь:

  • Солевое связывание с положительно заряженным Arg-145
  • Водородная связь из Tyr-248
  • Водородная связь из азота амида Asn-144

Механизм

Карбоксипептидаза А, классифицируемая как металлоэкзопептидаза, состоит из одной полипептидной цепи, связанной с ионом цинка. Этот характерный ион металла расположен в активном центре фермента вместе с пятью аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании субстрата: Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145, Tyr-248 и Glu- 270. Рентгеноструктурные исследования выявили пять участков белка. Эти аллостерические сайты участвуют в создании специфичности лиганд-фермент, наблюдаемой у большинства биоактивных ферментов. Один из этих субсайтов вызывает конформационное изменение Tyr-248 при связывании молекулы субстрата в первичном активном сайте. Фенольный гидроксил тирозина образует водородную связь с концевым карбоксилатом лиганда. Кроме того, между тирозином и пептидной связью более длинных пептидных субстратов образуется вторая водородная связь. Эти изменения значительно усиливают связь между ферментом и лигандом, будь то субстрат или ингибитор. Это свойство карбоксипептидазы А привело к первому пункту Дэниел Э. Кошланд-младший Гипотеза «индуцированного соответствия».

S1 В этом субсайте происходит катализ в CPA, а ион цинка координируется остатками ферментов Glu-72, His-69 и His-196. Существует плоскость, которая пересекает бороздку активного центра, где остатки Glu-270 и Arg-127 находятся на противоположных сторонах комплекса, связанного с цинком и водой. Цинк богат электронами благодаря глутаминовым лигандам, координирующим цинк, потому что до связывания субстрата Glu-72 координирует бидентатно, но смещается в монодентатный после связывания субстрата. В результате металлический цинк не может депротонировать координированную молекулу воды с образованием гидроксильного нуклеофила.[2]

Фигура 2. CPA-катализируемый протеолиз, стимулируемый координированной молекулой воды.

Glu-270 и Arg-127 играют важную роль в катализе, показанном на рис. 2. Arg-127 действует, стабилизируя карбонил субстрата, который связан с аминогруппой фенилаланина. Одновременно молекула воды, координированная с цинком, депротонируется Glu-270 и взаимодействует с карбонилом, стабилизированным Arg-127. Это создает промежуточное соединение, показанное на фиг. 2, где отрицательно заряженный кислород координируется с цинком, и благодаря неблагоприятным электростатическим взаимодействиям между Glu-270 и ионизированным продуктом облегчается высвобождение продукта в конце катализа.[2]

В недавних компьютерных исследованиях механизм катализа аналогичен, но разница в механизме заключается в том, что молекула депротонированной воды связывается с углеродом карбонила, тогда как на рисунке 2 показано, что гидроксильная группа остается скоординированной с цинком. Затем происходит протеолиз, и молекула воды снова вводится в активный центр для координации с цинком.[3]

Было проведено несколько исследований, изучающих детали связи между карбоксипептидазой А и субстратом и ее влияние на скорость гидролиза. В 1934 году в ходе кинетических экспериментов было впервые обнаружено, что для связывания субстрата гидролизуемый пептид должен находиться рядом с концевой свободной гидроксильной группой. Также скорость гидролиза может быть увеличена, если С-концевой остаток является разветвленным алифатическим или ароматическим. Однако, если субстрат представляет собой дипептид со свободной аминогруппой, он медленно подвергается гидролизу; этого, однако, можно избежать, если аминогруппа блокируется N-ацилированием.[4]

Совершенно очевидно, что структура фермента, а точнее его активный центр, очень важна для понимания механизма реакции. По этой причине Рис и его коллеги изучили комплекс фермент-лиганд, чтобы получить четкий ответ на роль иона цинка. Эти исследования показали, что в свободном ферменте координационное число цинка равно пяти; металлический центр координирован с двумя атомами азота имидазола Nδ1, двумя карбоксилатными атомами кислорода глутамата-72 и молекулой воды с образованием искаженного тетраэдра. Однако, как только лиганд связывается в активном центре карбоксипептидазы A, это координационное число может варьироваться от пяти до шести. При связывании с дипептидом глицил-L-тирозином аминный азот дипептида и карбонильный кислород замещают водный лиганд. Это дало бы координационное число шесть для цинка в комплексе карбоксипептидаза А-дипептид-глицил-L-тирозин. Карты электронной плотности показали, что аминный азот занимает вторую позицию рядом с глутаматом-270. Близость этих двух остатков приведет к стерическому затруднению, препятствующему координации водного лиганда с цинком. Это приведет к координационному числу пять. Данные по обоим значительны, указывая на то, что обе ситуации возникают естественным образом.[5]

Существует два предполагаемых механизма каталитической функции карбоксипептидазы А. Первый представляет собой нуклеофильный путь с участием ковалентного ацильного промежуточного фермента, содержащего основание активного центра Glu-270. Свидетельства для этого промежуточного ангидрида неоднозначны; Сух и его коллеги выделили то, что предполагается ацильным промежуточным соединением. Однако подтверждение наличия ацильного фермента было выполнено без экспериментов по улавливанию, что делает выводы слабыми.[1]

Второй предложенный механизм - это продвижение воды. Этот механизм включает атаку молекулы воды на разрезную пептидную связь субстрата. Этому процессу способствует ион цинка и остаток Glu-270.[1]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Кристиансон Д.В., Липскомб В.Н. (февраль 1989 г.). «Карбоксипептидаза А». Отчеты о химических исследованиях. 22 (2): 62–9. Дои:10.1021 / ar00158a003.
  2. ^ а б c d е Кристиансон, Д., В., и Липскомб, В., Н. (1989) Карбоксипептидаза А. Американское химическое общество, Том (22): 62-69.
  3. ^ Вальдес CE, Моргенштерн А., Эберхарт М.Е., Александрова А.Н. (ноябрь 2016 г.). «Прогностические методы для вычислительной редизайна металлоферментов - тестовый пример с карбоксипептидазой А». Физическая химия Химическая физика. 18 (46): 31744–31756. Bibcode:2016PCCP ... 1831744В. Дои:10.1039 / c6cp02247b. PMID  27841396.
  4. ^ Липскомб WN (март 1970 г.). «Структура и механизм ферментативной активности карбоксипептидазы А и отношения к химической последовательности». Отчеты о химических исследованиях. 3 (3): 81–9. Дои:10.1021 / ar50027a001.
  5. ^ Рис, Д. К., Льюис М., Хонзатко Р. Б., Липскомб В. Н., Хардман К. Д. (июнь 1981 г.). «Цинковая среда и цис-пептидные связи в карбоксипептидазе А с разрешением 1,75-А». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 78 (6): 3408–12. Bibcode:1981PNAS ... 78.3408R. Дои:10.1073 / пнас.78.6.3408. ЧВК  319577. PMID  6943549.

внешняя ссылка