Аффинная хроматография - Affinity chromatography

Аффинная хроматография это метод отделения биомолекулы от смеси, основанный на очень специфических макромолекулярное связывание взаимодействие биомолекулы с другим веществом. Конкретный тип связывающего взаимодействия зависит от интересующей биомолекулы; антиген и антитело, фермент и субстрат, рецептор и лиганд, или же белок и нуклеиновая кислота[1] связывающие взаимодействия часто используются для выделения различных биомолекул. Аффинная хроматография полезна своим высоким избирательность и разрешающая способность разлуки,[2][3] по сравнению с другими хроматографическими методами.

Принцип

Аффинная хроматография использует преимущества специфических связывающих взаимодействий между интересующим аналитом (обычно растворенным в Мобильная фаза ), и партнер по связыванию или лиганд (иммобилизованный на стационарная фаза ). В типичном эксперименте по аффинной хроматографии лиганд присоединен к твердой нерастворимой матрице - обычно полимер Такие как агароза или же полиакриламид - химически модифицирован для введения реактивного функциональные группы с которым лиганд может реагировать, образуя стабильные ковалентные связи.[4] Стационарную фазу сначала загружают в колонку, в которую вводят подвижную фазу. Молекулы, которые связываются с лигандом, останутся связанными с неподвижной фазой. Затем применяется промывочный буфер для удаления нецелевых биомолекул путем нарушения их более слабого взаимодействия с неподвижной фазой, в то время как представляющие интерес биомолекулы остаются связанными. Затем биомолекулы-мишени можно удалить с помощью так называемого буфера для элюирования, который нарушает взаимодействия между связанными биомолекулами-мишенями и лигандом. Таким образом, целевая молекула восстанавливается в элюирующем растворе.[5]

Аффинная хроматография не требует знания молекулярной массы, заряда, гидрофобности или других физических свойств интересующего аналита, хотя знание его связывающих свойств полезно при разработке протокола разделения.[5] Типы связывающих взаимодействий, обычно используемые в процедурах аффинной хроматографии, кратко изложены в таблице ниже.

Типичные биологические взаимодействия, используемые в аффинной хроматографии[6]

Старший НетТипы лигандовЦелевая молекула
1Аналог субстратаФерменты
2АнтителаАнтиген
3ЛектинПолисахарид
4Нуклеиновая кислотаДополнительная базовая последовательность
5ГормонРецептор
6АвидинБиотин / биотин-конъюгированная молекула
7КальмодулинПартнер связывания кальмодулина
8ГлутатионСлитый белок GST
9Белки А и GИммуноглобулины
10Ионы металловСлитый белок с поли-гистидином


Пакетные и колоночные настройки

Колоночная хроматография
Периодическая хроматография

Связывание с твердой фазой может быть достигнуто с помощью колоночной хроматографии, при которой твердая среда набивается на колонку, исходная смесь проходит через колонку для осаждения, промывочный буфер проходит через колонку, а буфер для элюирования затем наносится на колонку и собирается . Эти действия обычно выполняются при атмосферном давлении. В качестве альтернативы связывание может быть достигнуто с использованием периодической обработки, например, путем добавления исходной смеси к твердой фазе в сосуде, перемешивания, разделения твердой фазы, удаления жидкой фазы, промывки, повторного центрифугирования, добавления буфера для элюирования, повторное центрифугирование и удаление элюата.

Иногда используется гибридный метод, при котором связывание осуществляется периодическим методом, но твердая фаза со связанной молекулой-мишенью набивается на колонку, а промывание и элюирование осуществляются на колонке.

Лиганды, используемые в аффинной хроматографии, получают как из органических, так и из неорганических источников. Примерами биологических источников являются белки сыворотки, лектины и антитела. Неорганические источники в виде дебильных веществ, хелатов металлов и триазиновых красителей.[7]

Также был разработан третий метод, абсорбция расширенным слоем, который сочетает в себе преимущества двух методов, упомянутых выше. Частицы твердой фазы помещаются в колонну, где жидкая фаза закачивается снизу и выходит наверху. Плотность частиц гарантирует, что твердая фаза не покидает колонну с жидкой фазой.

Столбцы сродства могут быть элюированный изменяя концентрацию солей, pH, pI, заряд и ионную силу напрямую или через градиент для разделения интересующих частиц.

Совсем недавно были разработаны установки, в которых последовательно используется более одной колонки. Преимущество по сравнению с установками с одной колонкой состоит в том, что полимерный материал может быть полностью загружен, поскольку несвязывающий продукт напрямую подается в следующую колонку со свежим материалом колонки. Эти хроматографические процессы известны как периодическая противоточная хроматография (PCC). Таким образом, можно резко снизить затраты на смолу на количество произведенного продукта. Поскольку одна колонка всегда может быть элюирована и регенерирована, в то время как другая колонка загружена, уже двух колонок достаточно, чтобы в полной мере использовать преимущества.[8] Дополнительные колонки могут обеспечить дополнительную гибкость в отношении времени элюирования и регенерации за счет дополнительного оборудования и затрат на смолу.

Конкретное использование

Аффинная хроматография может использоваться в ряде приложений, включая очистку нуклеиновых кислот, очистку белков.[9] из бесклеточных экстрактов и очищение от крови.

Используя аффинную хроматографию, можно отделить белки, которые связываются с определенным фрагментом, от белков, которые не связываются с этим конкретным фрагментом.[10] Поскольку этот метод очистки зависит от биологических свойств необходимого белка, это полезный метод, и белки можно очищать во много раз за один этап.[11]

Различные СМИ по интересам

Существует множество различных аффинити-медиа для множества возможных применений.[12][13] Вкратце, они (обобщенные) активированные / функционализированные, которые работают как функциональный спейсер, поддерживающая матрица и исключают работу с токсичными реагентами.

Аминокислотные среды используются с множеством сывороточных белков, белков, пептидов и ферментов, а также рРНК и дцДНК. Авидин биотиновая среда используется в процессе очистки биотина / авидина и их производных.

Углеводное связывание чаще всего используется с гликопротеинами или любым другим углеводосодержащим веществом; углевод используется с лектинами, гликопротеинами или любым другим белком метаболита углеводов. Среда с красителем-лигандом неспецифична, но имитирует биологические субстраты и белки. Глутатион полезен для разделения рекомбинантных белков, меченных GST. Гепарин - это общий аффинный лиганд, и он наиболее полезен для разделения белков свертывания плазмы, наряду с ферментами нуклеиновых кислот и липазами.

Среды для гидрофобного взаимодействия чаще всего используются для нацеливания на свободные карбоксильные группы и белки.

Иммуноаффинная среда (подробно описанная ниже) использует высокую специфичность антигенов и антител для разделения; аффинная хроматография с иммобилизованным металлом подробно описана ниже и использует взаимодействия между ионами металлов и белками (обычно специально помеченными) для разделения; нуклеотид / кофермент, который работает для разделения дегидрогеназ, киназ и трансаминаз.

Нуклеиновые кислоты улавливают мРНК, ДНК, рРНК и другие нуклеиновые кислоты / олигонуклеотиды. Метод протеина A / G используется для очистки иммуноглобулинов.

Специальные среды предназначены для определенного класса или типа белка / кофермента; этот тип среды будет работать только для разделения определенного белка или кофермента.

Иммуноаффинность

Еще одно применение процедуры - аффинная очистка антител из сыворотки крови. Если известно, что сыворотка содержит антитела против определенного антигена (например, если сыворотка получена из организма, иммунизированного против соответствующего антигена), то ее можно использовать для аффинной очистки этого антигена. Это также известно как иммуноаффинная хроматография. Например, если организм иммунизирован против слитого с GST белка, он будет продуцировать антитела против слитого белка и, возможно, также антитела против GST-метки. Затем белок может быть ковалентно связан с твердой подложкой, такой как агароза, и использован в качестве аффинного лиганда при очистке антитела из иммунной сыворотки.

Для тщательности каждый из белков GST и GST-слитый белок может быть соединен отдельно. Первоначально сыворотке дают возможность связываться с аффинной матрицей GST. Это удалит антитела против GST части гибридного белка. Затем сыворотку отделяют от твердой подложки и дают возможность связываться с матрицей слитого с GST белка. Это позволяет любым антителам, распознающим антиген, улавливаться на твердой подложке. Элюирование представляющих интерес антител чаще всего достигается с помощью низкого pH буфер, такой как глицин pH 2,8. Элюат собирают в нейтральный трис или фосфатный буфер, чтобы нейтрализовать элюирующий буфер с низким pH и остановить любое снижение активности антитела. Это хороший пример, поскольку аффинная очистка используется для очистки исходного слитого с GST белка, для удаления нежелательных антител против GST из сыворотки и для очистки целевого антитела.

Моноклональные антитела также могут быть выбраны для связывания белков с высокой специфичностью, когда белок высвобождается в довольно мягких условиях. Это может пригодиться для дальнейших исследований в будущем.[14]

Упрощенная стратегия часто используется для очистки антител, генерируемых против пептида. антигены. Когда пептидные антигены производятся синтетически, концевой цистеин остаток добавляется либо к N-, либо к C-концу пептида. Этот остаток цистеина содержит сульфгидрил функциональная группа, которая позволяет пептиду легко конъюгировать с белком-носителем (например, гемоцианин лимфы улитки (KLH)). Тот же цистеинсодержащий пептид также иммобилизуется на агарозной смоле через остаток цистеина и затем используется для очистки антитела.

Наиболее моноклональные антитела были очищены с помощью аффинной хроматографии на основе иммуноглобулин -специфический Белок А или же Белок G, полученный из бактерий.[15]

Иммуноаффинная хроматография также является основой для иммунохроматографических тест-полосок (ICT), которые обеспечивают быстрый способ диагностики при лечении пациентов. Используя ИКТ, технический специалист может сделать определение у постели пациента без необходимости в лаборатории.[16] Обнаружение ИКТ очень специфично для микроба, вызывающего инфекцию.[17]

Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов

Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) основана на специфической координационной ковалентной связи аминокислот, в частности гистидина, с металлами. Этот метод работает, позволяя белкам со сродством к ионам металлов удерживаться в колонке, содержащей ионы иммобилизованных металлов, таких как кобальт, никель, медь, для очистки гистидин-содержащих белков или пептидов, железа, цинка или галлия для очистки фосфорилированные белки или пептиды. Многие природные белки не обладают сродством к ионам металлов, поэтому технология рекомбинантной ДНК может использоваться для введения такой белковой метки в соответствующий ген. Методы, используемые для элюировать представляющий интерес белок включает изменение pH или добавление конкурентной молекулы, такой как имидазол.[18][19]

Хроматографическая колонка, содержащая гранулы никель-агарозы, используемая для очистки белков с гистидиновыми метками.
Смотрите также: Полигистидин-тег

Рекомбинантные белки

Возможно, наиболее распространенное использование аффинной хроматографии - очистка рекомбинантных белков. Белки с известным сродством белок с меткой чтобы помочь их очищению. Белок мог быть генетически модифицирован, чтобы позволить его отобрать для аффинного связывания; это известно как гибридный белок. Теги включают гексагистидин (Его ), глутатион -S-трансфераза (GST) и мальтоза связывающий белок (MBP). Гистидин теги имеют сходство с никель, кобальт, цинк, медь и утюг ионы, которые были иммобилизованы путем образования координационных ковалентных связей с хелатором, включенным в неподвижную фазу. Для элюирования избыточное количество соединения, способного действовать как лиганд иона металла, такого как имидазол, используется. GST имеет сродство к глутатиону, который коммерчески доступен в иммобилизованном виде в виде глутатион-агарозы. Во время элюирования избыток глутатиона используется для вытеснения меченого белка.

Лектины

Лектин Аффинная хроматография - это форма аффинной хроматографии, где лектины используются для разделения компонентов в образце. Лектины, такие как конканавалин А представляют собой белки, которые могут связывать определенные молекулы углеводов альфа-D-маннозы и альфа-D-глюкозы. Некоторые распространенные молекулы углеводов, которые используются в лектиновой аффинной хроматографии, - это Con A-сефароза и WGA-агароза.[20] Другой пример лектина - агглютинин зародышей пшеницы, который связывает D-N-ацетил-глюкозамин.[21] Чаще всего применяется разделение гликопротеины из негликозилированных белков, или один гликоформ из другого гликоформа.[22] Хотя существуют различные способы проведения лектиновой аффинной хроматографии, целью является извлечение сахарного лиганда желаемого белка.[20]

Специальность

Еще одно применение аффинной хроматографии - очистка определенных белков с использованием гелевой матрицы, уникальной для конкретного белка. Например, очистку β-галактозидазы E. coli проводят с помощью аффинной хроматографии с использованием п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагарозы в качестве аффинной матрицы. п-аминобенил-1-тио-β-D-галактопиранозилагароза используется в качестве аффинной матрицы, поскольку она содержит галактопиранозильную группу, которая служит хорошим аналогом субстрата для E.Coli-B-галактозидазы. Это свойство позволяет ферменту связываться с неподвижной фазой аффинной матрицы и элюируется путем добавления увеличивающихся концентраций соли в колонку.[23]

Щелочная фосфатаза

Щелочная фосфатаза из E. coli можно очистить с использованием матрицы DEAE-целлюлоза. A. фосфатаза имеет небольшой отрицательный заряд, что позволяет ей слабо связываться с положительно заряженными аминогруппами в матрице. Затем фермент можно элюировать добавлением буфера с более высокими концентрациями соли.[24]

Боронатная аффинная хроматография

Боронатная аффинная хроматография состоит из использования бороновой кислоты или боронатов для элюирования и количественного определения количества гликопротеины. В клинических адаптациях этот тип хроматографии был применен для определения долгосрочной оценки пациентов с диабетом посредством анализ их гликированного гемоглобина.[21]

Очистка сывороточного альбумина

Из многих применений аффинной хроматографии одно из ее применений - аффинная очистка от загрязнения альбумином и макроглобулином. Этот тип очистки помогает удалить избыток альбумина и α2- контаминация макроглобулином при масс-спектрометрии. При аффинной очистке сывороточного альбумина стационарным устройством, используемым для сбора или привлечения сывороточных белков, может быть Cibacron Blue-Sepharose. Затем белки сыворотки могут быть элюированы из адсорбента буфером, содержащим тиоцианат (SCN−).[25]

Слабая аффинная хроматография

Слабая аффинная хроматография[26] (WAC) - это метод аффинной хроматографии для скрининга аффинности при разработке лекарств.[27][28] WAC основан на сродстве жидкостная хроматография техника, которая разделяет химические соединения на основе их различного слабого сродства к иммобилизованной цели. Чем выше сродство соединения к мишени, тем дольше оно остается в блоке разделения, и это будет выражаться как более длительное время удерживания. Измерение аффинности и ранжирование аффинности может быть достигнуто путем обработки полученных значений времени удерживания анализируемых соединений.

Технология WAC демонстрируется на множестве различных белок цели - протеазы, киназы, шапероны и белок-белковое взаимодействие (PPI) цели. Было показано, что WAC более эффективен, чем известные методы для скрининга на основе фрагментов.[28]

Рекомендации

  1. ^ Айзпуруа-Олайзола, Ойер; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Fu, Ou; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж .; Питерс, Роланд Дж. (Январь 2018 г.). "Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов". Электрофорез. 39 (2): 344–347. Дои:10.1002 / elps.201700207. PMID  28905402.
  2. ^ Нинфа, Александр Дж .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Вайли. п. 133. ISBN  9780470087664.
  3. ^ ""Введение в аффинную хроматографию"". bio-rad.com. Bio-Rad. 2020-09-14. Получено 2020-09-14.
  4. ^ Захариу, Майкл (редактор) (2008). Аффинная хроматография: методы и протоколы (2-е изд.). Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. ISBN  9781588296597.CS1 maint: дополнительный текст: список авторов (связь)
  5. ^ а б Боннер, Филип Л. (2007). Очистка белков (2-е изд.). Тотова, штат Нью-Джерси: Taylor & Francis Group. ISBN  9780415385114.
  6. ^ Кумар, Пранав (2018). Биофизика и молекулярная биология. Нью-Дели: Издание Pathfinder. п. 11. ISBN  978-93-80473-15-4.
  7. ^ Фанали, Сальваторе; Haddad, Paul R .; Пул, Колин Ф .; Шенмейкерс, Питер; Ллойд, Дэвид, ред. (2013). Жидкостная хроматография: применение. Справочники по разделению науки. Сент-Луис: Эльзевьер. п. 3. ISBN  9780124158061.
  8. ^ Баур, Даниэль; Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Штейнебах, Фабиан; Морбиделли, Массимо (2016). «Сравнение периодического и непрерывного процессов захвата белка A на нескольких колонках по оптимальному дизайну». Биотехнологический журнал. 11 (7): 920–931. Дои:10.1002 / biot.201500481. PMID  26992151.
  9. ^ «Куб Биотех». Куб Биотех. Получено 2019-09-11.
  10. ^ Ахерн, Кевин (12 февраля 2015 г.). Биохимия бесплатно и легко. DaVinci Press; 3-е издание. п. 822.
  11. ^ М., Гришэм, Чарльз (01.01.2013). Биохимия. Брукс / Коул, Cengage Learning. ISBN  978-1133106296. OCLC  777722371.
  12. ^ «Куб Биотех». Куб Биотех. Получено 2019-09-11.
  13. ^ «Аффинная хроматография».
  14. ^ Томпсон, Нэнси Э .; Фоли, Кэтрин М .; Stalder, Elizabeth S .; Берджесс, Ричард Р. (2009). Руководство по очистке белков, 2-е издание. Методы в энзимологии. 463. С. 475–494. Дои:10.1016 / с0076-6879 (09) 63028-7. ISBN  9780123745361. PMID  19892188.
  15. ^ Улен М (2008). «Сродство как инструмент науки о жизни». Биотехнологии. 44 (5): 649–54. Дои:10.2144/000112803. PMID  18474040.
  16. ^ Луппа, Питер (2018). Тестирование в местах оказания медицинской помощи: принципы и клиническое применение. Берлин, Германия: Springer. С. 71–72. ISBN  9783662544976.
  17. ^ Дж. Д. Мюллер; К. Р. Уилкс; К. Дж. О'Райли; Р. Дж. Кондрон; Р. Булл; А. Матечун (2004). «Специфика иммунохроматографического теста на сибирскую язву». Австралийский ветеринарный журнал. 82 (4): 220–222. Дои:10.1111 / j.1751-0813.2004.tb12682.x. PMID  15149073.
  18. ^ Singh, Naveen K .; DSouza, Roy N .; Bibi, Noor S .; Фернандес-Лахор, Марсело (2015). «Глава 16 Прямое улавливание белков с меткой His6 с использованием мегапористых криогелей, разработанных для металло-ионной аффинной хроматографии». В Reichelt, S. (ред.). Аффинная хроматография. Методы молекулярной биологии. 1286. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press. С. 201–212. Дои:10.1007/978-1-4939-2447-9_16. ISBN  978-1-4939-2447-9. PMID  25749956.
  19. ^ Габерк-Порекар, Владка К .; Менарт, Виктор (2001). «Перспективы аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом». J Biochem Биофизические методы. 49 (1–3): 335–360. Дои:10.1016 / S0165-022X (01) 00207-X. PMID  11694288.
  20. ^ а б Фриз, Х. Х. (май 2001 г.). Лектиновая аффинная хроматография. Текущие протоколы в науке о белке. Глава 9. С. 9.1.1–9.1.9. Дои:10.1002 / 0471140864.ps0901s00. ISBN  978-0471140863. ISSN  1934-3663. PMID  18429210.
  21. ^ а б Хейдж, Дэвид (май 1999 г.). «Аффинная хроматография: обзор клинического применения» (PDF). Клиническая химия. 45 (5): 593–615. Дои:10.1093 / Clinchem / 45.5.593. PMID  10222345.
  22. ^ "GE Healthcare Life Sciences, Иммобилизованный лектин". Архивировано из оригинал на 2012-03-03. Получено 2010-11-29.
  23. ^ Нинфа, Александр Дж .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2006). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Вайли. п. 153.
  24. ^ Нинфа, Александр Дж .; Ballou, David P .; Бенор, Марили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы в биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Хобокен, Нью-Джерси: Джон Уайли. п. 240. ISBN  9780470087664. OCLC  420027217.
  25. ^ Военно-морской флот, Хавьер; Кальво, Мигель; Лампрев, Фермин; Пиньейро, Андрес (1 января 1983 г.). «Аффинная хроматография сывороточного альбумина: иллюстративный лабораторный эксперимент по биомолекулярным взаимодействиям». Биохимическое образование. 11 (1): 5–8. Дои:10.1016/0307-4412(83)90004-3. ISSN  1879-1468.
  26. ^ Zopf, D .; С. Олсон (1990). «Слабоаффинная хроматография». Природа. 346 (6279): 87–88. Bibcode:1990 Натур.346 ... 87Z. Дои:10.1038 / 346087a0. ISSN  0028-0836.
  27. ^ Duong-Thi, M.D .; Meiby, E .; Bergström, M .; Fex, T .; Isaksson, R .; Олсон, С. (2011). «Слабая аффинная хроматография как новый подход к скринингу фрагментов при открытии лекарств». Аналитическая биохимия. 414 (1): 138–146. Дои:10.1016 / j.ab.2011.02.022. PMID  21352794.
  28. ^ а б Meiby, E .; Simmonite, H .; Le Strat, L .; Дэвис, В .; Матасова, Н .; Moore, J.D .; Мросек, М .; Мюррей, Дж .; Hubbard, R.E .; Олсон, С. (2013). «Скрининг фрагментов с помощью хроматографии слабого сродства: сравнение с установленными методами скрининга против HSP90». Аналитическая химия. 85 (14): 6756–6766. Дои:10.1021 / ac400715t. PMID  23806099.

внешняя ссылка

«Принцип, процедура и предварительное подробное описание аффинной хроматографии - 2020».

Библиотечные ресурсы о
Аффинная хроматография