Ионная хроматография - Ion chromatography

Современная система ионной хроматографии

Ионообменная хроматография

Акроним	IC, IEC
Классификация	Хроматография
Другие техники
Связанный	Высокоэффективная жидкостная хроматография Водная нормально-фазовая хроматография Эксклюзионная хроматография Мицеллярная жидкостная хроматография

Ионная хроматография (или же ионный обмен хроматография) разделяет ионы и полярные молекулы основанный на их близости к ион обменник. Работает практически на любых заряженная молекула —В том числе большие белки, маленький нуклеотиды, и аминокислоты. Однако ионная хроматография должна выполняться в условиях, удаленных на одну единицу от изоэлектрическая точка протеина.^[1]

Два типа ионной хроматографии - анионообменная и катионообменная. Катионообменная хроматография используется, когда интересующая молекула заряжена положительно. Молекула заряжена положительно, потому что pH для хроматографии меньше pI (a / k / a pH (I)).^[2] В этом типе хроматографии неподвижная фаза заряжена отрицательно, а положительно заряженные молекулы притягиваются к ней. Анионообменная хроматография - это когда неподвижная фаза заряжена положительно, а отрицательно заряженные молекулы (что означает, что pH для хроматографии больше, чем pI) загружаются, чтобы притягиваться к ней.^[3] Часто используется для очистки белков, анализа воды,^[4][5] и контроль качества. Водорастворимые и заряженные молекулы, такие как белки, аминокислоты и пептиды, связываются с части которые имеют противоположный заряд, образуя ионные связи с нерастворимой неподвижной фазой.^[6] Уравновешенная неподвижная фаза состоит из ионизируемой функциональной группы, где целевые молекулы смеси, подлежащей разделению и количественному определению, могут связываться при прохождении через колонку - катионная неподвижная фаза используется для разделения анионов, а анионная неподвижная фаза используется для разделения катионов. Катионообменная хроматография используется, когда желательными молекулами для разделения являются катионы, а анионообменная хроматография используется для разделения анионов.^[7] Затем связанные молекулы могут быть элюированы и собраны с использованием элюента, содержащего анионы и катионы, путем пропускания более высокой концентрации ионов через колонку или изменения pH колонны.

Одним из основных преимуществ использования ионной хроматографии является только одно взаимодействие, задействованное во время разделения, по сравнению с другими методами разделения; следовательно, ионная хроматография может иметь более высокую устойчивость к матрице. Еще одно преимущество ионного обмена - предсказуемость схем элюирования (на основе присутствия ионизируемой группы).^[8] Например, когда используется катионообменная хроматография, катионы будут элюироваться последними. Между тем, сначала вымываются отрицательно заряженные молекулы. Однако при проведении ионообменной хроматографии есть и недостатки, такие как постоянное изменение метода, которое приводит к несогласованности от колонки к колонке.^[9] Основным ограничением этого метода очистки является то, что он ограничен ионизируемой группой.^[2]

История

Ионообменная хроматография

Ионная хроматография развивалась благодаря накоплению знаний в течение многих лет. Начиная с 1947 года Спеддинг и Пауэлл использовали вытесняющую ионообменную хроматографию для разделения редкоземельных элементов. Кроме того, они показали ионообменное разделение изотопов 14N и 15N в аммиаке. В начале 1950-х годов Краус и Нельсон продемонстрировали использование многих аналитических методов для ионов металлов в зависимости от их разделения на их хлоридные, фторидные, нитратные или сульфатные комплексы с помощью анионной хроматографии. Автоматическое обнаружение в потоке постепенно внедрялось с 1960 по 1980 год, так же как и новые хроматографические методы разделения ионов металлов. Новаторский метод Смолла, Стивенса и Баумана из Dow Chemical Co. открыл путь к созданию современной ионной хроматографии. Анионы и катионы теперь можно было эффективно разделять с помощью системы обнаружения подавленной проводимости. В 1979 году Gjerde et al. Представили метод анионной хроматографии с обнаружением неподавленной проводимости. Следом за ним в 1980 г. был разработан аналогичный метод катионной хроматографии.^[10]

В результате на рынке ИС начался период жесткой конкуренции, когда появились сторонники обнаружения как подавленной, так и неподавленной проводимости. Эта конкуренция привела к быстрому росту новых форм и быстрой эволюции IC.^[11] Проблема, которую необходимо решить в будущем развитии ИС, - это изготовление высокоэффективных монолитных ионообменных колонок, и преодоление этой проблемы будет иметь большое значение для развития ИС.^[12]

Бум ионообменной хроматографии начался в период с 1935 по 1950 год во время Второй мировой войны и пришелся на "Манхэттенский проект «Это применение и IC были значительно расширены. Ионная хроматография была первоначально введена двумя английскими исследователями, сэром Томпсоном в области сельского хозяйства и химиком JT Way. Работы Томпсона и Уэй касались воздействия водорастворимых солей удобрений, сульфата аммония и хлорида калия. соли не могли быть легко извлечены из земли из-за дождя. Они использовали ионные методы для обработки глин солями, что привело к экстракции аммиака в дополнение к выделению кальция.^{[13][ненадежный источник? ]} Именно в пятидесятые и шестидесятые годы были разработаны теоретические модели для IC для дальнейшего понимания, и только в семидесятых годах стали использоваться детекторы непрерывного действия, проложившие путь для развития от хроматографии низкого давления к высокоэффективной. Лишь в 1975 году термин «ионная хроматография» был принят в качестве названия, относящегося к методам, и впоследствии использовался как название в маркетинговых целях. Сегодня IC важен для исследования водных систем, таких как питьевая вода. Это популярный метод анализа анионных элементов или комплексов, который помогает решать экологически важные проблемы. Кроме того, он также широко используется в полупроводник промышленность.

Из-за обилия разделительных столбцов, элюирование Имеются системы и детекторы, хроматография превратилась в основной метод ионного анализа.^[14]

Когда этот метод был первоначально разработан, он в основном использовался для очистки воды. С 1935 года ионообменная хроматография быстро превратилась в один из наиболее востребованных методов, принципы которого часто применяются в большинстве областей химии, включая дистилляцию, адсорбцию и фильтрацию.^[15]

Принцип

Ионная хроматограмма, показывающая разделение анионов

Ионообменная хроматография разделяет молекулы на основе их соответствующих заряженных групп. Ионообменная хроматография сохраняет аналит молекул на колонке на основе кулоновский (ионные) взаимодействия. Матрица ионообменной хроматографии состоит из положительно и отрицательно заряженных ионов.^[16] По сути, молекулы подвергаются электростатическому взаимодействию с противоположными зарядами на матрице неподвижной фазы. Стационарная фаза состоит из неподвижной матрицы, содержащей заряженные ионизируемые функциональные группы или лиганды.^[17] На поверхности неподвижной фазы отображаются ионные функциональные группы (R-X), которые взаимодействуют с ионами аналита с противоположным зарядом. Для достижения электронейтральности эти инертные заряды соединяются с обменными противоионами в растворе. Ионизируемые молекулы, подлежащие очистке, конкурируют с этими обмениваемыми противоионами за связывание с иммобилизованными зарядами на неподвижной фазе. Эти ионизируемые молекулы удерживаются или элюируются в зависимости от их заряда. Сначала смываются молекулы, которые не связываются или не связываются слабо с неподвижной фазой. Измененные условия необходимы для элюирования молекул, которые связываются с неподвижной фазой. Концентрация обмениваемых противоионов, которые конкурируют с молекулами за связывание, может быть увеличена, или может быть изменен pH. Изменение pH влияет на заряд определенных молекул и, следовательно, изменяет связывание. Затем молекулы начинают элюироваться в зависимости от изменений их зарядов в результате корректировок. В дальнейшем такие корректировки можно использовать для высвобождения интересующего белка. Кроме того, можно постепенно изменять концентрацию противоионов для разделения ионизированных молекул. Этот тип элюирования называется градиентным элюированием. С другой стороны, можно использовать ступенчатое элюирование, при котором концентрация противоионов изменяется за один этап.^[1] Этот тип хроматографии далее подразделяется на катионообменную хроматографию и анионообменная хроматография. Положительно заряженные молекулы связываются с катионообменными смолами, а отрицательно заряженные молекулы - с анионообменными смолами.^[18] Ионное соединение, состоящее из катионных частиц M + и анионных частиц B-, может удерживаться неподвижной фазой.

Катионообменная хроматография сохраняет положительно заряженные катионы потому что стационарная фаза отображает отрицательно заряженную функциональную группу:

${\displaystyle {\text{R-X}}^{-}{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{R-X}}^{-}{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{B}}^{-}}$

Анионообменная хроматография сохраняет анионы с использованием положительно заряженной функциональной группы:

${\displaystyle {\text{R-X}}^{+}{\text{A}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}}^{-}\rightleftarrows \,{\text{R-X}}^{+}{\text{B}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{A}}^{-}}$

Обратите внимание, что ионную силу C + или A- в подвижной фазе можно регулировать, чтобы сместить положение равновесия, таким образом, время удерживания.

Ионная хроматограмма представляет собой типичную хроматограмму, полученную с помощью анионообменной колонки.

Процедура

Перед тем как начать ионообменную хроматографию, ее необходимо уравновесить. Стационарная фаза должна соответствовать определенным требованиям, которые зависят от эксперимента, с которым вы работаете. После уравновешивания заряженные ионы в неподвижной фазе будут присоединяться к противоположно заряженным ионам, способным к обмену. Обменные ионы, такие как Cl- или Na +. Затем следует выбрать буфер, в котором желаемый белок может связываться. После уравновешивания колонку необходимо промыть. Фаза промывки поможет элюировать все примеси, которые не связываются с матрицей, в то время как интересующий белок остается связанным. Этот буфер для образца должен иметь такой же pH, что и буфер, используемый для уравновешивания, чтобы помочь связать желаемые белки. Незаряженные белки будут элюироваться из колонки с той же скоростью, что и буфер, протекающий через колонку. После того, как образец был загружен в колонку и колонка была промыта буфером для элюирования всех нежелательных белков, выполняется элюирование для элюирования желаемых белков, которые связаны с матрицей. Связанные белки элюируются с использованием градиента линейно возрастающей концентрации соли. С увеличением ионной силы буфера ионы соли будут конкурировать с желаемыми белками, чтобы связываться с заряженными группами на поверхности среды. Это вызовет элюирование желаемых белков из колонки. Белки с низким чистым зарядом будут элюированы первыми, поскольку концентрация соли увеличивается, вызывая увеличение ионной силы. Белки с высоким чистым зарядом потребуют более высокой ионной силы для их элюирования из колонки.^[16] Можно проводить ионообменную хроматографию в объеме, на тонких слоях среды, таких как стеклянные или пластиковые пластины, покрытые слоем желаемой неподвижной фазы, или на хроматографических колонках. Тонкослойная хроматография или колоночная хроматография имеют сходство в том, что они действуют в рамках одних и тех же руководящих принципов; при движении подвижной фазы вдоль неподвижной фазы происходит постоянный и частый обмен молекулами. Не обязательно добавлять образец в минутных объемах, так как предварительно определенные условия для обменной колонки были выбраны так, чтобы было сильное взаимодействие между подвижной и стационарной фазами. Кроме того, механизм процесса элюирования будет вызывать компартментализацию различных молекул на основе их соответствующих химических характеристик. Это явление происходит из-за увеличения концентрации соли в верхней части колонки или около нее, тем самым смещая молекулы в этом положении, в то время как молекулы, связанные ниже, высвобождаются в более поздний момент, когда более высокая концентрация соли достигает этой области. Эти принципы являются причиной того, что ионообменная хроматография является отличным кандидатом для начальных этапов хроматографии в сложной процедуре очистки, поскольку она может быстро давать небольшие объемы целевых молекул независимо от большего начального объема.^[2]

Камера (слева) содержит высокую концентрацию соли. Камера перемешивания (справа) содержит низкую концентрацию соли. Постепенное перемешивание вызывает образование градиента соли по мере перемещения соли от высоких к низким концентрациям.

Для нанесения нередко используются сравнительно простые приспособления. противоионы увеличения градиента к хроматографической колонке. Противоионы, такие как медь (II), чаще всего выбирают для эффективного разделения пептидов и аминокислот посредством образования комплексов.^[19]

Для создания солевого градиента можно использовать простое устройство. Буфер для элюирования постоянно втягивается из камеры в смесительную камеру, тем самым изменяя его концентрацию. Обычно буфер, помещаемый в камеру, обычно имеет высокую начальную концентрацию, тогда как буфер, помещенный в камеру с мешалкой, обычно имеет низкую концентрацию. По мере того, как буфер с высокой концентрацией из левой камеры смешивается и всасывается в колонку, концентрация буфера в перемешиваемой колонке постепенно увеличивается. Изменение формы камеры с перемешиванием, а также ограничительного буфера позволяет получать вогнутые, линейные или выпуклые градиенты противоиона.

Для стационарной фазы используется множество различных сред. Среди наиболее часто используемых иммобилизованных заряженных групп являются триметиламиноэтил (ТАМ), триэтиламиноэтил (TEAE), диэтил-2-гидроксипропиламиноэтил (QAE), аминоэтил (AE), диэтиламиноэтил (DEAE), сульфо (S), сульфометил (SM), сульфометил (SM), сульфометил (SM), SP), карбокси (C) и карбоксиметил (CM).^[1]

Удачная упаковка колонки - важный аспект ионной хроматографии. Стабильность и эффективность последней колонки зависит от методов насадки, используемого растворителя и факторов, влияющих на механические свойства колонки. В отличие от ранних неэффективных методов сухой упаковки, насадка для влажной суспензии, при которой частицы, взвешенные в соответствующем растворителе, доставляются в колонну под давлением, демонстрирует значительное улучшение. При выполнении влажной упаковки суспензии можно использовать три различных подхода: метод сбалансированной плотности (плотность растворителя примерно равна плотности пористых частиц диоксида кремния), метод высокой вязкости (используется растворитель высокой вязкости) и метод суспензии низкой вязкости (выполняется с растворителями с низкой вязкостью).^[20]

Полистирол используется как среда для ионного обмена. Он производится путем полимеризации стирола с использованием дивинилбензола и пероксида бензоила. Такие обменники образуют гидрофобные взаимодействия с белками, которые могут быть необратимыми. Из-за этого свойства ионообменники из полистирола не подходят для разделения белков. С другой стороны, они используются для разделения небольших молекул при разделении аминокислот и удалении соли из воды. Ионообменники из полистирола с большими порами могут использоваться для отделения белка, но должны быть покрыты гидрофильным веществом.^[21]

Среда на основе целлюлозы может использоваться для разделения больших молекул, поскольку они содержат большие поры. Связывание с белками в этой среде высокое и имеет низкий гидрофобный характер. DEAE представляет собой анионообменную матрицу, которая образуется из положительной боковой группы диэтиламиноэтила, связанной с целлюлозой или сефадексом.^[22]

Среда на основе агарозного геля также содержит большие поры, но их замещающая способность ниже по сравнению с декстранами. Способность среды набухать в жидкости основана на сшивании этих веществ, pH и концентрации ионов используемых буферов.^[21]

Использование высокой температуры и давления позволяет значительно повысить эффективность ионной хроматографии при сокращении времени. Температура оказывает влияние на селективность из-за ее влияния на удерживающие свойства. Фактор удержания (k = (т_р^грамм − т_M^грамм)/(т_M^грамм − т_доб)) увеличивается с температурой для малых ионов, а для более крупных ионов наблюдается обратная тенденция.^[23][24]

Несмотря на ионную селективность в различных средах, проводятся дальнейшие исследования для проведения ионообменной хроматографии в диапазоне 40–175 ° C.^[25]

Подходящий растворитель можно выбрать на основании наблюдений за поведением частиц колонки в растворителе. Используя оптический микроскоп, можно легко отличить желаемое диспергированное состояние суспензии от агрегированных частиц.^[20]

Слабые и сильные иониты

«Сильный» ионообменник не потеряет заряд на своей матрице, когда колонка уравновесится, и поэтому можно использовать широкий диапазон буферов pH. «Слабые» ионообменники имеют диапазон значений pH, в котором они сохранят свой заряд. Если pH буфера, используемого для колонки со слабым ионным обменом, выходит за пределы диапазона емкости матрицы, колонка теряет свое распределение заряда и интересующая молекула может быть потеряна.^[26] Несмотря на меньший диапазон pH слабых ионообменников, они часто используются вместо сильных ионообменников из-за их большей специфичности. В некоторых экспериментах время удерживания слабых ионообменников достаточно велико для получения желаемых данных с высокой специфичностью.^[27]

Смолы (часто называемые «шариками») ионообменных колонок могут включать функциональные группы, такие как слабые / сильные кислоты и слабые / сильные основания. Также существуют специальные колонки со смолами с амфотерными функциональными группами, которые могут обмениваться как катионами, так и анионами.^[28] Некоторые примеры функциональных групп сильных ионообменных смол: катион четвертичного аммония (Q), который является анионообменником, и сульфоновая кислота (S, -SO₂OH), который является катионитом.^[29] Эти типы теплообменников могут сохранять свою плотность заряда в диапазоне pH 0–14. Примеры функциональных групп смол со слабым ионным обменом включают диэтиламиноэтил (DEAE, -C₂ЧАС₄N (CH₂ЧАС₅)₂), который является анионообменником, и карбоксиметил (CM, -CH₂-COOH),^[30] который является катионитом. Эти два типа теплообменников могут поддерживать плотность заряда своих колонок в диапазоне pH 5–9.^{[нужна цитата ]}

В ионной хроматографии взаимодействие растворенных ионов и неподвижной фазы на основе их зарядов определяет, какие ионы будут связываться и в какой степени. Когда в неподвижной фазе есть положительные группы, притягивающие анионы, ее называют анионообменником; когда на неподвижной фазе есть отрицательные группы, катионы притягиваются, и это катионообменник.^[31] Притяжение между ионами и неподвижной фазой также зависит от смолы, органических частиц, используемых в качестве ионообменников.

Каждая смола отличается относительной селективностью, которая варьируется в зависимости от присутствующих растворенных ионов, которые будут конкурировать за связывание с группой смолы на неподвижной фазе. Коэффициент селективности, эквивалентный константе равновесия, определяется через соотношение концентраций между смолой и каждым ионом, однако общая тенденция такова, что ионообменники предпочитают связываться с ионом с более высоким зарядом, меньшим радиусом гидратации и более высокая поляризуемость или способность электронного облака иона разрушаться другими зарядами.^[32] Несмотря на эту селективность, избыточные количества иона с более низкой селективностью, вводимые в колонку, заставили бы меньший ион больше связываться с неподвижной фазой, поскольку коэффициент селективности допускает флуктуации реакции связывания, которая имеет место во время ионообменной хроматографии.

В следующей таблице показаны обычно используемые ионообменники. ^[33]

Старший Нет	Имя	Тип	Функциональная группа
1	DEAE Целлюлоза (анионообменник)	Слабо базовый	DEAE (диэтиламиноэтил)
2	QAE Sephadex (анионообменник)	Сильно простой	QAE (четвертичный аминоэтил)
3	Q Сефароза (анионообменник)	Сильно простой	Q (четвертичный аммоний)
4	CM-целлюлоза (катионит)	Слабокислый	CM (карбоксиметил)
5	SP Сефароза (Катионит)	Сильнокислый	SP (сульфопропил)
6	ИСТОЧНИК S (Катионит)	Сильнокислый	S (метилсульфат)

Типичная техника

Образец вводится вручную или с помощью автосэмплер, в образец петли известного объема. А буферизованный водный раствор, известный как подвижная фаза, переносит образец из петли в колонку, которая содержит некоторую форму материала неподвижной фазы. Обычно это полимерная или гелевая матрица, состоящая из агароза или же целлюлоза бусы с ковалентно связанные заряженные функциональные группы. Уравновешивание неподвижной фазы необходимо для получения желаемого заряда колонки. Если колонка не уравновешена должным образом, желаемая молекула не может прочно связываться с колонкой. Целевые аналиты (анионы или катионы) удерживаются в неподвижной фазе, но могут быть элюированный за счет увеличения концентрации одноименно заряженных частиц, которые вытесняют ионы аналита из неподвижной фазы. Например, в катионообменной хроматографии положительно заряженный аналит можно вытеснить путем добавления положительно заряженных ионов натрия. Затем интересующие аналиты должны быть обнаружены некоторыми способами, обычно с помощью проводимость или поглощение УФ / видимого света.

Для управления системой IC обычно требуется система данных хроматографии (CDS). В дополнение к системам IC, некоторые из этих CDS могут также управлять газовая хроматография (ГХ) и ВЭЖХ.

Мембранная обменная хроматография

Тип ионообменной хроматографии, мембранный обмен^[34][35] это относительно новый метод очистки, разработанный для преодоления ограничений использования колонок с шариками. Мембранная хроматография^[36][37] Устройства дешевы для массового производства и одноразовые, в отличие от других хроматографических устройств, которые требуют обслуживания и времени для повторной валидации. Есть три типа мембранных поглотителей, которые обычно используются при разделении веществ. Эти три типа: плоский лист, полое волокно и радиальный поток. Наиболее распространенный абсорбер, который лучше всего подходит для мембранной хроматографии, - это несколько плоских листов, поскольку он имеет больший абсорбирующий объем. Его можно использовать для преодоления ограничений массопереноса.^[38] и падение давления,^[39] что делает его особенно полезным для выделения и очистки вирусов, плазмидной ДНК и других крупных макромолекул. Колонка заполнена микропористыми мембранами с внутренними порами, которые содержат адсорбционные части, которые могут связывать целевой белок. Адсорбционные мембраны доступны с различной геометрией и химическим составом, что позволяет использовать их для очистки, а также фракционирования, концентрирования и осветления с эффективностью, в 10 раз превышающей эффективность использования шариков.^[40] Мембраны могут быть получены путем изоляции самой мембраны, когда мембраны разрезаются на квадраты и иммобилизуются. Более поздний метод включал использование живых клеток, которые прикреплены к поддерживающей мембране и используются для идентификации и уточнения сигнальных молекул.^[41]

Разделение белков

Ионообменная колонка препаративного размера, используемая для очистка белка.

Ионообменная хроматография может использоваться для разделения белков, поскольку они содержат заряженные функциональные группы. Интересующие ионы (в данном случае заряженные белки) обмениваются на другие ионы (обычно H⁺) на заряженной твердой опоре. Растворенные вещества чаще всего находятся в жидкой фазе, которая обычно представляет собой воду. Возьмем, к примеру, белки в воде, которая будет жидкой фазой, проходящей через колонку. Колонку обычно называют твердой фазой, поскольку она заполнена пористыми синтетическими частицами с определенным зарядом. Эти пористые частицы также называются гранулами, могут быть аминированы (содержать аминогруппы) или иметь ионы металлов для того, чтобы иметь заряд. Колонка может быть изготовлена ​​с использованием пористых полимеров, для макромолекул более 100000 оптимальный размер пористой частицы составляет около 1 мкм.². Это связано с тем, что медленная диффузия растворенных веществ в порах не ограничивает качество разделения.^[42] Гранулы, содержащие положительно заряженные группы, которые притягивают отрицательно заряженные белки, обычно называют анионообменными смолами. Аминокислоты с отрицательно заряженными боковыми цепями при pH 7 (pH воды) - это глутамат и аспартат. Отрицательно заряженные гранулы называются катионообменными смолами, так как положительно заряженные белки будут притягиваться. Аминокислоты с положительно заряженными боковыми цепями при pH 7 - это лизин, гистидин и аргинин.^[43]

Изоэлектрическая точка - это pH, при котором соединение - в данном случае белок - не имеет чистого заряда. Изоэлектрическая точка белка или PI может быть определена с использованием pKa боковых цепей, если амино (положительная цепь) способна нейтрализовать карбоксильную (отрицательную) цепь, белок будет иметь свой PI. Использование буферов вместо воды для белков, которые не имеют заряда при pH 7, является хорошей идеей, так как позволяет изменять pH для изменения ионных взаимодействий между белками и гранулами.^[44] Слабокислые или основные боковые цепи могут иметь заряд, если pH высокий или достаточно низкий соответственно. Разделение может быть достигнуто на основе естественной изоэлектрической точки белка. В качестве альтернативы к белку может быть генетически добавлена ​​пептидная метка, чтобы придать белку изоэлектрическую точку, отличную от большинства природных белков (например, 6 аргининов для связывания с катионообменной смолой или 6 глутаматов для связывания с анионообменной смолой, такой как DEAE -Сефароза).

Элюирование за счет увеличения ионной силы подвижной фазы более тонкое. Это работает, потому что ионы из подвижной фазы взаимодействуют с иммобилизованными ионами на неподвижной фазе, таким образом «экранируя» неподвижную фазу от протеина и позволяя протеину элюироваться.

Элюирование из ионообменных колонок может быть чувствительным к изменениям одного заряда - хроматофокусировка. Ионообменная хроматография также полезна при выделении специфических мультимерных белковых ансамблей, что позволяет очищать специфические комплексы как по количеству, так и по положению заряженных пептидных меток.^[45][46]

Эффект Гиббса – Доннана

В ионообменной хроматографии Эффект Гиббса – Доннана наблюдается, когда значения pH применяемого буфера и ионообменника различаются даже до одной единицы pH. Например, в анионообменных колонках ионообменники отталкивают протоны, поэтому pH буфера рядом с колонкой отличается выше, чем у остального растворителя.^[47] В результате экспериментатор должен следить за тем, чтобы интересующий белок (белки) был стабильным и должным образом заряжался при «фактическом» pH.

Этот эффект возникает в результате того, что две одинаково заряженные частицы, одна из смолы, а другая из раствора, не могут должным образом распределиться между двумя сторонами; происходит избирательное поглощение одного иона по сравнению с другим.^[48][49] Например, в сульфированной полистирольной смоле, катионообменной смоле, ион хлора солянокислотного буфера должен уравновешиваться в смоле. Однако, поскольку концентрация сульфоновой кислоты в смоле высока, водород HCl не имеет тенденции попадать в колонку. Это, в сочетании с необходимостью электронейтральности, приводит к тому, что в смолу попадает минимальное количество водорода и хлора.^[49]

Использует

Клиническая полезность

Использование ионной хроматографии можно увидеть в ионной хроматографии серебра.^{[нужна цитата ]} Обычно серебро и соединения, содержащие ацетиленовые и этиленовые связи, имеют очень слабые взаимодействия. Это явление было широко проверено на олефиновых соединениях. Ионные комплексы, которые олефины образуют с ионами серебра, являются слабыми и основаны на перекрытии пи-, сигма- и d-орбиталей, поэтому доступные электроны не вызывают реальных изменений в двойной связи. Этим поведением манипулировали для разделения липидов, в основном жирных кислот, от смесей на фракции с различным количеством двойных связей с использованием ионов серебра. Ионные смолы пропитывали ионами серебра, которые затем подвергали воздействию различных кислот (кремниевая кислота) для элюирования жирных кислот с различными характеристиками.

Предел обнаружения ионов щелочных металлов составляет всего 1 мкМ.^[50]Может использоваться для измерения HbA1c, порфирин и с очистка воды. Ионообменные смолы (ИОС) широко используются, особенно в медицине, из-за их высокой емкости и несложной системы процесса разделения.Одно из синтетических применений - использование ионообменных смол для диализа почек. Этот метод используется для разделения элементов крови с помощью искусственной почки, покрытой целлюлозной мембраной.^[51]

Еще одно клиническое применение ионной хроматографии - это метод быстрой анионообменной хроматографии, используемый для отделения изоферментов креатинкиназы (КК) от человеческой сыворотки и тканей, полученных из материала аутопсии (в основном использовались ткани, богатые КК, такие как сердечная мышца и мозг).^{[нужна цитата ]} Эти изоферменты включают MM, MB и BB, которые все выполняют одну и ту же функцию при различных аминокислотных последовательностях. Функции этих изоферментов - преобразовывать креатин с использованием АТФ в фосфокреатин, вытесняя АДФ. Мини-колонки заполняли DEAE-сефадексом A-50 и дополнительно элюировали трис-буфером хлорида натрия в различных концентрациях (каждая концентрация выбиралась преимущественно для изменения элюирования). Экстракт тканей человека помещали в колонки для разделения. Все фракции были проанализированы, чтобы увидеть общую активность CK, и было обнаружено, что каждый источник изоферментов CK имел характерные изоферменты, обнаруженные внутри. Сначала элюировали CK-MM, затем CK-MB, а затем CK-BB. Следовательно, изоферменты, обнаруженные в каждом образце, могут использоваться для идентификации источника, поскольку они тканеспецифичны.

Используя информацию из результатов, можно сделать корреляцию между диагнозом пациентов и типом изоферментов CK, обнаруженных с наибольшей активностью. По результатам исследования, около 35 из 71 изученного пациента страдали сердечным приступом (инфарктом миокарда), также содержавшим большое количество изоферментов CK-MM и CK-MB. Результаты также показывают, что при многих других диагнозах, включая почечную недостаточность, цереброваскулярные заболевания и легочные заболевания, обнаружен только изофермент CK-MM, а не другой изофермент. Результаты этого исследования указывают на корреляцию между различными заболеваниями и обнаруженными изоферментами CK, что подтверждает результаты предыдущих тестов с использованием различных методов. Исследования, касающиеся CK-MB, обнаруженного у жертв сердечного приступа, расширились после этого исследования и применения ионной хроматографии.

Промышленное применение

С 1975 года ионная хроматография широко используется во многих отраслях промышленности. Основными полезными преимуществами являются надежность, очень хорошая точность и прецизионность, высокая селективность, высокая скорость, высокая эффективность разделения и низкая стоимость расходных материалов. Наиболее значительными разработками, связанными с ионной хроматографией, являются новые методы пробоподготовки; повышение скорости и селективности разделения аналитов; снижение пределов обнаружения и количественного определения; расширение области применения; разработка новых стандартных методик; миниатюризация и расширение области анализа на новую группу веществ. Позволяет проводить количественное тестирование электролита и фирменных присадок гальваника ванны.^[52] Это продвижение качественного клетка корпуса тестирование или менее точное УФ-тестирование. Ионы, катализаторы, отбеливатели и ускорители можно измерить.^[52] Ионно-обменная хроматография постепенно стала широко известным универсальным методом обнаружения как анионных, так и катионных частиц. Приложения для таких целей были разработаны или находятся в стадии разработки для различных областей интересов, в частности, для фармацевтической промышленности. Использование ионообменной хроматографии в фармацевтике расширилось в последние годы, и в 2006 году в список официально была добавлена ​​глава по ионообменной хроматографии. Фармакопия США -Национальный формуляр (USP-NF). Кроме того, в выпуске USP-NF в 2009 году Фармакопия США сделала доступным несколько анализов ионной хроматографии с использованием двух методов: определения проводимости, а также импульсного амперометрический обнаружение. Большинство этих приложений в основном используются для измерения и анализа остаточных пределов в фармацевтических препаратах, включая определение пределов оксалата, йодида, сульфата, сульфамата, фосфата, а также различных электролитов, включая калий и натрий. В целом, издание USP-NF от 2009 года официально выпустило двадцать восемь методов обнаружения для анализа активных соединений или компонентов активных соединений с использованием либо обнаружения проводимости, либо импульсного амперометрического обнаружения.^[53]

Разработка лекарств

Система ионной хроматографии, используемая для обнаружения и измерения катионов, таких как натрий, аммоний и калий, в составах от отхаркивающего кашля.

Растет интерес к применению ИК в анализе фармацевтических препаратов. IC используется в различных аспектах разработки продукта и тестирования контроля качества. Например, IC используется для повышения стабильности и растворимости молекул фармацевтически активных лекарственных средств, а также для обнаружения систем, которые имеют более высокую толерантность к органическим растворителям. IC использовался для определения аналитов как часть теста на растворение. Например, тесты растворения кальция показали, что другие ионы, присутствующие в среде, могут хорошо разделяться между собой, а также с ионом кальция. Таким образом, IC используется в лекарствах в форме таблеток и капсул для определения количества лекарственного средства, растворяющегося с течением времени.^[54] IC также широко используется для обнаружения и количественного определения вспомогательных веществ или неактивных ингредиентов, используемых в фармацевтических препаратах. Обнаружение сахара и сахарного спирта в таких составах с помощью IC было выполнено благодаря тому, что эти полярные группы разделяются в ионной колонке. Методология IC также применяется при анализе примесей в лекарственных веществах и продуктах. Примеси или любые компоненты, которые не являются частью химического вещества лекарственного средства, оцениваются, и они дают представление о максимальных и минимальных количествах лекарственного средства, которые следует вводить пациенту в день.^[55]

Смотрите также

• Анионообменная хроматография
• Хроматофокусирование
• Высокоэффективная жидкостная хроматография
• Изоэлектрическая точка

Рекомендации

1. Нинфа, Александр Дж., Дэвид П. Баллоу и Марили Бенор (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Хобокен, Нью-Джерси: Джон Уайли
2. Нинфа, Александр; Баллоу, Дэвид; Бенор, Марили (26 мая 2009 г.). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии. Вайли. С. 143–145. ISBN  978-0470087664.
3. «Принципы ионообменной хроматографии». separations.us.tosohbioscience.com. Получено 1 мая 2018.
4. «Справочник по мониторингу промышленных сточных вод». Агентство по охране окружающей среды (США). Август 1973 г.. Получено 30 июля 2016.
5. Данбровски А., Хубицки З., Подкосцельни П. и Робенс Э. (2004). Селективное удаление ионов тяжелых металлов из вод и промышленных сточных вод ионообменным методом. Chemosphere, 56 (2), 91-106.
6. Лукман, Мохаммад и Инамуддин (2012). Технология ионного обмена II. Springer Нидерланды. п. 1. ISBN  978-94-007-4026-6.
7. Фриц, Джеймс С. (1987). «Ионная хроматография». Аналитическая химия. 59 (4): 335A – 344A. Дои:10.1021 / ac00131a002.
8. Сигел, Майлз (май 1997 г.). «Быстрая очистка библиотек малых молекул с помощью ионообменной хроматографии». Буквы Тетраэдра. 38 (19): 3357–3358. Дои:10.1016 / S0040-4039 (97) 00650-3.
9. Нойбауэр, Кеннет. «Преимущества и недостатки различных типов колонок для анализа видообразования с помощью ЖХ-ИСП-МС». Spectroscopyonline.com. Получено 9 мая 2016.
10. Фриц, Дж. С. (2004). «Первые вехи в развитии ионообменной хроматографии: личный кабинет». Журнал хроматографии А. 1039 (1–2): 3–12. Дои:10.1016 / с0021-9673 (04) 00020-2. PMID  15250395.
11. Люси, К. А. (2003). «Эволюция ионного обмена: от Моисея до Манхэттенского проекта и до Нового времени». Журнал хроматографии А. 1000 (1–2): 711–24. Дои:10.1016 / s0021-9673 (03) 00528-4. PMID  12877196.
12. «Последние разработки и новые направления в ионной хроматографии».
13. Andylong. «История ионообменной хроматографии». Ионная хроматография. Архивировано из оригинал 24 апреля 2016 г.. Получено 9 мая 2016.
14. Эйт, Клаудиа, Колб Максимилиан и Себерт Андреас (2002). "Введение в Практическая ионная хроматография Введение. Эд. Viehweger Kai. Херизау: Metrohm. п. 160.
15. Наход, Ф. К. (1940). Ионный обмен: теория и применение. Почвоведение. 68. С. 1, 2. Bibcode:1949 г.ПочваС..68С.414.. Дои:10.1097/00010694-194911000-00021. ISBN  978-0124312999.
16. Принципы и методы ионообменной хроматографии. Компания Дженерал Электрик. 2004. С. 11–20.
17. Юнгбауэр, Алоис; Хан, Райнер (2009). «Глава 22 Ионообменная хроматография». Руководство по очистке белков, 2-е издание. Методы в энзимологии. 463. С. 349–371. Дои:10.1016 / S0076-6879 (09) 63022-6. ISBN  9780123745361. PMID  19892182.
18. Дуонг-Ли, К. С .; Габелли, С. Б. (2014). «Использование ионообменной хроматографии для очистки рекомбинантно экспрессируемого белка». Лабораторные методы в энзимологии: белок, часть C. Методы в энзимологии. 541. С. 95–103. Дои:10.1016 / B978-0-12-420119-4.00008-2. ISBN  9780124201194. PMID  24674065.
19. Дитер, Дебра С .; Уолтон, Гарольд Ф. (1 ноября 1983 г.). «Противоионные эффекты в ионообменной распределительной хроматографии». Аналитическая химия. 55 (13): 2109–2112. Дои:10.1021 / ac00263a025.
20. Киркланд, Дж. Дж .; ДеСтефано, Дж. Дж. (8 сентября 2006 г.). «Искусство и наука создания насадочных аналитических колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии А. Роль теории в хроматографии. 1126 (1–2): 50–57. Дои:10.1016 / j.chroma.2006.04.027. PMID  16697390.
21. Янсон, Ян-Кристер. (2011). Очистка белков: принципы, методы высокого разрешения и применения. Джон Вили и сыновья.
22. Лаки, Джон (2010). Словарь по биохимии. Издательство Оксфордского университета. ISBN  9780199549351.
23. Воутерс, Берт; Брюггинк, Сиз; Десмет, Герт; Агроскин, Юрий; Pohl, Christopher A .; Элтинк, Себастьян (21 августа 2012 г.). «Капиллярная ионная хроматография при высоком давлении и температуре». Аналитическая химия. 84 (16): 7212–7217. Дои:10.1021 / ac301598j. PMID  22830640.
24. Escuder-Gilabert, L .; Bermúdez-Saldaña, J.M .; Вильянуэва-Каманьяс, Р. М .; Медина-Эрнандес, М. Дж .; Саградо, С. (16 апреля 2004 г.). «Надежность оценки коэффициента удерживания в жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии А. 1033 (2): 247–255. Дои:10.1016 / j.chroma.2004.01.038. PMID  15088745.
25. Шибукава, Масами; Симасаки, Томоми; Сайто, Синго; Ярита, Такаши (1 октября 2009 г.). "Ионообменная хроматография перегретой воды: экспериментальный подход к интерпретации селективности разделения в ионообменных процессах". Аналитическая химия. 81 (19): 8025–8032. Дои:10.1021 / ac9011864. PMID  19743878.
26. Апплинг, Дин; Энтони-Кэхилл, Спенсер; Мэтьюз, Кристофер (2016). Биохимия: концепции и связи. Нью-Джерси: Пирсон. п. 134. ISBN  9780321839923.
27. Альперт, Эндрю Дж .; Худец, Отто; Мехтлер, Карл (5 мая 2015 г.). «Анионообменная хроматография фосфопептидов: слабый анионный обмен по сравнению с сильным анионообменом и анионообменная хроматография по сравнению с хроматографией с электростатическим отталкиванием и гидрофильным взаимодействием». Аналитическая химия. 87 (9): 4704–4711. Дои:10.1021 / ac504420c. ЧВК  4423237. PMID  25827581.
28. Dragan, E. S .; Avram, E .; Дину, М. В. (1 июля 2006 г.). «Органические ионообменники в виде шариков. Синтез, характеристика и применение». Полимеры для передовых технологий. 17 (7–8): 571–578. Дои:10.1002 / pat.755.
29. Швелленбах, Дж., Тафт, Ф., Злодей, Л., и Штрубе, Дж. (2016). Приготовление и определение характеристик высокоемких прочных катионообменных волокнистых адсорбентов. Журнал хроматографии А, 1447, 92-106.
30. Hollabaugh, C.B .; Burt, Leland H .; Уолш, Анна Петерсон (октябрь 1945 г.). "Карбоксиметилцеллюлоза ... Использование и применение". Промышленная и инженерная химия. 37 (10): 943–947. Дои:10.1021 / ie50430a015.
31. Харрис, Дэниел С. (2010). Количественный химический анализ. Нью-Йорк: В. Х. Фриман и компания. п. 637. ISBN  978-1429218153.
32. Харрис, Дэниел С. (2010). Количественный химический анализ. Нью-Йорк: В. Х. Фриман и компания. п. 638. ISBN  978-1429218153.
33. Кумар, Панав (2018). Основы и методы биофизики и молекулярной биологии. Нью-Дели: Издание Pathfinder. п. 7. ISBN  978-93-80473-15-4.
34. Кнудсен, Х. Л., Фарнер, Р. Л., Сюй, Ю., Норлинг, Л. А., и Бланк, Г. С. (2001). Мембранная ионообменная хроматография для очистки антител в промышленных масштабах. Журнал хроматографии А, 907 (1), 145-154.
35. Шаркосет, К. (1998). Очистка белков мембранной хроматографией. Журнал химической технологии и биотехнологии, 71 (2), 95-110.
36. Бой, К. (2007). Мембранные адсорберы как инструменты очистки для очистки моноклональных антител. Журнал хроматографии B, 848 (1), 19-27.
37. Томмес Дж. И Кула М. Р. (1995). Мембранная хроматография - интегративная концепция последующей обработки белков. Прогресс биотехнологии, 11 (4), 357-367.
38. Брандт, S (1988). «Аффинная технология на основе мембран для промышленных очисток». Био / Технологии. 6 (7): 779–782. Дои:10.1038 / nbt0788-779.
39. Ян, Хивон; Виера, Кларивель; Фишер, Иоахим; Этцель, Марк Р. (2002). «Очистка большого белка с помощью ионообменных мембран». Исследования в области промышленной и инженерной химии. 41 (6): 1597–1602. Дои:10.1021 / ie010585l.
40. Ропер, Д. Кейт; Лайтфут, Эдвин Н. (1995). «Разделение биомолекул с помощью адсорбционных мембран». Журнал хроматографии А. 702 (1–2): 3–26. Дои:10.1016 / 0021-9673 (95) 00010-К.
41. Какулитан, Niña G .; Кай, Хироюки; Liu, Eulanca Y .; Фэй, Николь; Ю, Ян; Лохмюллер, Теобальд; О’Донохью, Джефф П .; Гровс, Джей Т. (2014). «Хроматография на основе размера сигнальных кластеров в мембране живой клетки». Нано буквы. 14 (5): 2293–2298. Bibcode:2014NanoL..14.2293C. Дои:10.1021 / nl404514e. ЧВК  4025576. PMID  24655064.
42. Свец, Франтишек .; Фреше, Жан М. Дж. (1992). «Непрерывные стержни из макропористого полимера в качестве разделительной среды для высокоэффективной жидкостной хроматографии». Аналитическая химия. 64 (7): 820–822. Дои:10.1021 / ac00031a022.
43. Гаррет, Реджинальд Х .; Гришэм, Чарльз М. (2009). Биохимия (4-е изд.). Пасифик Гроув, Калифорния: Брукс / Коул. С. 71–75. ISBN  978-0-495-11464-2.
44. Дасгупта, Пурненду Κ. (1992). "Современная ионная хроматография". Аналитическая химия. 64 (15): 775A – 783A. Дои:10.1021 / ac00039a722.
45. Sakash, J.B .; Кантровиц, Э. Р. (2000). «Вклад отдельных межцепочечных взаимодействий в стабилизацию состояний T и R аспартат-транскарбамоилазы Escherichia coli». J Biol Chem. 275 (37): 28701–7. Дои:10.1074 / jbc.M005079200. PMID  10875936.
46. Фэйрхед, М. (2013). «Соединение по принципу Plug-and-Play через определенные двухвалентные стрептавидины». Дж Мол Биол. 426 (1): 199–214. Дои:10.1016 / j.jmb.2013.09.016. ЧВК  4047826. PMID  24056174.
47. Хефтманн, Эрих (2004). Хроматография. Основы и приложения хроматографии и связанных с ней методов дифференциальной миграции: приложения. Амстердам: Эльзевир. п. 716. ISBN  9780080472256.
48. Грегор, Гарри П. (1951). "Равновесия Гиббса-Доннана в системах ионообменных смол". Журнал Американского химического общества. 73 (2): 642–650. Дои:10.1021 / ja01146a042.
49. Риман, Уильям, Гарольд Ф. Уолтон, Р. Белчер и Х. Фрейзер (2013). Ионный обмен в аналитической химии Международная серия монографий по аналитической химии. Берлингтон: Elsevier Science.
50. Хаузер, Питер К. (2016). «Глава 2. Определение ионов щелочных металлов в биологических и экологических пробах». В Астрид, Сигель; Гельмут, Сигель; Роланд К.О., Сигель (ред.). Ионы щелочных металлов: их роль в жизни. Ионы металлов в науках о жизни. 16. Springer. С. 11–25. Дои:10.1007/978-3-319-21756-7_2. ISBN  978-3-319-21755-0. PMID  26860298.
51. Лукман, Мохаммад и Инамуддин (2012). Технология ионного обмена II. Springer Нидерланды. п. 169. ISBN  978-94-007-4026-6.
52. Роберт Э. Смит (31 декабря 1987 г.). Приложения для ионной хроматографии. CRC Press. ISBN  978-0-8493-4967-6.
53. Бхаттачарья, Локеш; Рорер, Джеффри (2012). Применение ионной хроматографии в анализе фармацевтических и биологических продуктов. Вайли. п. 247. ISBN  978-0470467091.
54. Ханко, Валоран П .; Рорер, Джеффри С. (2012). "Анализ ионной хроматографии аминогликозидных антибиотиков". Применение ионной хроматографии для фармацевтических и биологических продуктов. п. 175. Дои:10.1002 / 9781118147009.ch8. ISBN  9781118147009.
55. Дженке, Д. (2011). «Применение ионной хроматографии в фармацевтическом и лекарственном анализе». Журнал хроматографической науки. 49 (7): 524–39. Дои:10.1093 / chrsci / 49.7.524. PMID  21801484.

Библиография

• Маленький, Хэмиш (1989). Ионная хроматография. Нью-Йорк: Пленум Пресс. ISBN  978-0-306-43290-3.
• Татьяна Вайс; Вайс, Иоахим (2005). Справочник по ионной хроматографии. Вайнхайм: Wiley-VCH. ISBN  978-3-527-28701-7.
• Gjerde, Douglas T .; Фриц, Джеймс С. (2000). Ионная хроматография. Вайнхайм: Wiley-VCH. ISBN  978-3-527-29914-0.
• Джексон, Питер; Хаддад, Пол Р. (1990). Ионная хроматография: принципы и применение. Амстердам: Эльзевир. ISBN  978-0-444-88232-5.
• Мерсер, Дональд В. (1974). «Разделение изоферментов креатинкиназы сыворотки и ткани с помощью ионообменной колоночной хроматографии». Клиническая химия. 20 (1): 36–40. PMID  4809470.
• Моррис, Л. Дж. (1966). «Разделение липидов методом ионной хроматографии серебра». Журнал липидных исследований. 7 (6): 717–732.
• Гош, Раджа (2002). «Разделение белков с помощью мембранной хроматографии: возможности и проблемы». Журнал хроматографии А. 952 (1): 13–27. Дои:10.1016 / s0021-9673 (02) 00057-2. PMID  12064524.

внешняя ссылка

• СМИ, связанные с Ионная хроматография в Wikimedia Commons

• Инструменты LC в Керли