Анионообменная хроматография - Anion-exchange chromatography

Анионообменная хроматография
АкронимHPAE[1]
КлассификацияИонообменная хроматография
Колоночная хроматография
Другие техники
СвязанныйХроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Водная нормально-фазовая хроматография
Эксклюзионная хроматография
Мицеллярная жидкостная хроматография

Анионообменная хроматография это процесс, который разделяет вещества на основе их заряда с помощью ионообменная смола содержащие положительно заряженные группы, такие как диэтиламиноэтильные группы (DEAE).[2] В растворе смола покрыта положительно заряженными противоионами (катионы ). Анионообменные смолы связываются с отрицательно заряженными молекулами, вытесняя противоион. Анионообменная хроматография обычно используется для очистки белки, аминокислоты, сахара /углеводы и другие кислотные вещества[3] с отрицательным зарядом при более высоком pH уровни. Плотность связи между веществом и смолой основана на силе отрицательного заряда вещества.

Общая методика очистки белка

В колонку наливают суспензию смолы, такой как DEAE-Sephadex. Используемая матрица нерастворима с ковалентно присоединенными заряженными группами. Эти заряженные группы называются обменниками, такими как катиониты и аниониты. После осаждения колонку предварительно уравновешивают в буфере перед нанесением белковой смеси. DEAE-Sephadex - это положительно заряженная суспензия, которая будет иметь электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными атомами, заставляя их элюировать позже, чем положительно заряженные молекулы в исследуемом образце. Этот метод разделения широко используется для обнаружения определенных белков или ферментов в организме.[2] Несвязанные белки собираются в потоке и / или при последующих промывках буфера. Белки, которые связываются с положительно заряженной смолой, удерживаются и могут быть элюированный одним из двух способов. Сначала постепенно увеличивают концентрацию соли в буфере для элюирования. Отрицательные ионы в солевом растворе (например, Cl−) конкурируют с белком за связывание со смолой. Во-вторых, pH раствора можно постепенно уменьшать, что приводит к более положительному заряду белка, высвобождая его из смолы. Оба эти метода могут вытеснить отрицательно заряженный белок, который затем элюируется в пробирки фракциями с буфером.[4][5][6]

Разделение белков будет зависеть от разницы в общем заряде. Состав ионизируемых групп боковой цепи будет определять общий заряд белка в конкретном pH. На изоэлектрическая точка (pI), общий заряд белка равен 0, и он не будет связываться с матрицей. Если pH выше pI, белок будет иметь отрицательный заряд и связываться с матрицей в анионообменной колонке. Стабильность белка при значениях выше или ниже pI будет определять, следует ли использовать анионообменную колонку или катионообменную колонку. Если он стабилен при значениях pH ниже pI, следует использовать катионообменную колонку. Если он стабилен при значениях pH выше pI, тогда можно использовать анионообменную колонку.[7]

Рекомендации

  1. ^ Ли, Ю. (1990). «Высокоэффективная анионообменная хроматография для анализа углеводов». Аналитическая биохимия. 189 (2): 151–62. Дои:10.1016 / 0003-2697 (90) 90099-у. PMID  2281856.
  2. ^ а б Фоцис, Т., Х. Адлеркрейц; Ярвенпяя, Паула; Сетчелл, К.Д.Р .; Axelson, M .; Sjövall, J. (1981). «Групповое разделение стероидных конъюгатов с помощью анионообменной хроматографии DEAE-Sephadex». Журнал стероидной биохимии. 14 (5): 457–63. Дои:10.1016/0022-4731(81)90357-5. PMID  7300338.
  3. ^ Роклин, Рой Д .; Поль, Кристофер А. (1983). «Определение углеводов с помощью анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием». Журнал жидкостной хроматографии. 6 (9): 1577–590. Дои:10.1080/01483918308064876.
  4. ^ Duong-Ly, Krisna C .; Габелли, Сандра Б. (2014). «Глава восьмая - Использование ионообменной хроматографии для очистки рекомбинантно экспрессируемого белка». Методы в энзимологии. Методы в энзимологии. Академическая пресса. 541: 95–103. Дои:10.1016 / b978-0-12-420119-4.00008-2. ISBN  9780124201194. PMID  24674065.
  5. ^ «Ионный обмен FPLC и хроматофокусирование: принципы и методы». Фармация Биотех. Pharmacia Biotech AB. 1985 г.
  6. ^ Руководство по ионообменной хроматографии. Гарвардский аппарат. п. 2.
  7. ^ Руководство по ионообменной хроматографии. Гарвардский аппарат. п. 3.