Картофельный вирус Y - Potato virus Y

Картофельный вирус Y
Классификация вирусов е
(без рейтинга):Вирус
Область:Рибовирия
Королевство:Орторнавиры
Тип:Писувирикота
Учебный класс:Stelpaviricetes
Заказ:Пататавиралес
Семья:Potyviridae
Род:Потивирус
Разновидность:
Картофельный вирус Y
Синонимы

вирус мозаики бринджала
Дурман 437 вирус
вирус акропетального некроза картофеля
вирус тяжелой мозаики картофеля
вирус полосатости вен табака

Картофельный вирус Y (PVY) это патогенный вирус растений семьи Potyviridae, и один из важнейших вирусов растений, поражающий картофель производство.

Заражение растений картофеля PVY приводит к появлению различных симптомы в зависимости от вирусного напряжение. Самым легким из этих симптомов является потеря продуктивности, но наиболее опасным является «кольцевая некротическая болезнь клубней картофеля» (PTNRD). Некротические кольцевые пятна делают картофель нерентабельным и, следовательно, могут привести к значительной потере дохода. PVY передается через тля векторы, но также могут оставаться бездействующий в семенном картофеле. Это означает, что использование одной и той же линии картофеля для производства семенного картофеля в течение нескольких последовательных поколений приведет к прогрессивному увеличению вирусной нагрузки и последующей потере обрезать.

Рост инфицирования картофеля вирусами за последние несколько лет привел к значительным потерям для картофельной промышленности Южной Африки. Повышенный уровень инфицирования можно объяснить несколькими факторами. К ним относятся заметное снижение эффективности и применения химикатов, используемых для борьбы с переносчиками болезней, использование зараженного семенного картофеля при выращивании, неправильное использование орошение и методы ведения сельского хозяйства, а также отсутствие чувствительного, быстрого и надежного метода обнаружения.[1] Повышение средней температуры зимы вследствие глобальное потепление также привело к увеличению численности тли, что, в свою очередь, привело к увеличению распространения вируса.[1][нужна цитата ]

Картофельный вирус Y хозяева, штаммы и симптомы

Картофель на примере кольцевой некротической болезни

PVY принадлежит к роду Потивирус, членом типа которого является. Потивирус - самый крупный род вирусов растений и, возможно, самый разрушительный для посевов картофеля.[2] В род включает более 200 видов, которые приносят значительные убытки в аграрной сфере.[3] PVY поражает многие хозяйственно важные виды растений. К ним относятся картофель (Solanum tuberosum), табак (Nicotiana tabacum), помидор (Solanum lycopersicum) и перец (Стручковый перец виды).[4] Уровень повреждения урожая определяется штаммом PVY, поражающим растения, вирусной нагрузкой, временем возникновения инфекции, а также толерантностью хозяина к вирусу.[5] Устойчивость хозяев к инфекции PVY во многих случаях низкая. Заражение поля картофеля PVY может в конечном итоге привести к потере урожая на 10-100%.[5]

Было показано, что PVY имеет разные изоляты в зависимости от симптомов, которые они вызывают у различных видов растений картофеля.[6] Обширная биологическая, серологическая и молекулярная вариабельность изолятов PVY делает особенно трудной классификацию изолятов как конкретных штаммов. Возникновение разнообразных симптомов и появление некротический PVYNTN привело к поиску более надежных инструментов классификации, чем простая серологическая идентификация. Традиционно выделяют три основных штамма PVY: PVYC, PVYN и PVYО. PVYC, первоначально известный как Картофельный вирус C, был признан первым и был идентифицирован в 1930-х годах.[7] PVYC побуждает гиперчувствительные реакции в широком ассортименте сортов картофеля. Эти реакции включают образование мягких мозаичных узоров или точечных полос. В отличие от других штаммов PVY, некоторые PVYC штаммы не передаются тлей.[8] Предыдущие исследования Visser и другие.[9] не идентифицировал ни один из местных изолятов как PVYC но сообщается, что это происходит в Южной Африке.[10][11] Второй штамм PVY - это PVY.N.[12] Некоторые заметки о подозреваемом варианте вируса Solanum 2 (Картофельный вирус Y).[12] Этот штамм был описан у растений табака, растущих рядом с растениями картофеля.[13] PVYN приводит к некрозу листьев и легкому повреждению клубней или даже его отсутствию. Обычный штамм PVY обозначается как PVY.О. Заражение растения картофеля PVYО штамм приводит к легкому повреждению клубней и не вызывает некроза листьев.[14] Оба PVYN и PVYО являются передаваемыми тлями и встречаются в Южной Африке. В Европе было показано, что эти два штамма рекомбинируют с образованием PVY.NTN.[15][16] ПВЙNTN был признан способным вызывать некротическую кольцевую пятнистость клубней картофеля (PTNRD).[15] Клубни, поврежденные PTNRD, становятся неликвидными, и заражение PVYNTN таким образом, приводит к большему экономическому воздействию, чем заражение другими штаммами.

Картофельный вирус Y коробка передач

PVY может передаваться растениям картофеля через прививка, инокуляция сока растений и через тля коробка передач. Наиболее распространенный способ заражения PVY растительного материала в полевых условиях - через тлю, и хотя тля сама по себе может напрямую повредить растения картофеля, именно их роль как вирусных переносчиков имеет наибольшее экономическое влияние.[17][18][19] В холодном климате тля зимует либо как бескрылая тля, рождающая живых детенышей (viviparae), либо как яйца. Такие растения-хозяева, как сорняки и другие культуры, служат рассадниками этой тли и образуют временную зону колонизации до того, как тля мигрирует на картофельные поля.[18] Считается, что в умеренном климате, например в Южной Африке, тля бесполым способом размножается на сорняках, других сельскохозяйственных культурах, местных растениях и садовых растениях. Это означает, что некоторое количество тлей присутствует круглый год. Важность эффективного и строгого мониторинга популяций тлей подчеркивается в обзоре Рэдклиффа и Рэгсдейла (2002), поскольку вирионы PVY попадают на картофельные поля почти исключительно крылатыми тлями из источника вируса за пределами этих полей. Бескрылая тля еще не была связана с распространением PVY на картофельных полях.[20]

Зеленая персиковая тля (Myzus persicae ) был признан наиболее эффективным в качестве вирусного вектора,[5][17][21] но другие, такие как Тля Fabae, Тля gossypii, Тля настуртия, Macrosiphum euphorbiae, Myzus (Нектаросифон) certus, Мызус (Phorodon) humuli и Ропалосифум вставка также сильно связаны с передачей вируса.[17][21] Совет по сельскохозяйственным исследованиям - Институт овощей и декоративных растений (ARC-VOPI) 6 Южной Африки идентифицировал двадцать пять видов тлей, способных функционировать как переносчики PVY.[22] Также была установлена ​​эффективность некоторых из этих тлей в качестве переносчиков PVY (Ragsdale et al., 2001), и было обнаружено, что они различаются у разных видов. В Южной Африке, Афис фаба, Тля gossypii и Тля настуртия являются наиболее распространенными и эффективными векторами PVY, встречающимися в данной области.[5] Помимо классификации по эффективности в качестве переносчиков, тлей также можно разделить на две подгруппы, а именно, колонизирующие и неколонизирующие виды. Колонизирующие тли - это тли, которые размножаются и приживаются на растениях картофеля, в частности, в то время как неколонизирующие тли не размножаются и не создают колоний на растениях картофеля. Колонизирующие тли лучше приспособлены к жизни на растениях картофеля и поэтому обычно считаются лучшими переносчиками PVY, чем неколонизирующие тли. Неколонизирующие тли в первую очередь не питаются растениями картофеля, но иногда питаются ими в поисках более подходящего хозяина. Их более низкая эффективность как вектора PVY нивелируется огромным количеством, в котором они встречаются.[19][23] По этой причине все тли, присутствующие на картофельных полях и вокруг них, должны рассматриваться как возможные переносчики, а их численность должна тщательно контролироваться.

Передача PVY тлей происходит непостоянным, не циркулирующим образом, что предполагает менее тесное взаимодействие между вирионом и вектором, чем в случае циркулирующих вирионов.[24] Тот факт, что вирионы передаются непостоянным образом, означает, что вирусная репликация не происходит внутри вектора тли и что, если тля не питается инфицированными растениями, она теряет способность заражать растения после двух-трех кормлений.[5][25] Вирионы прикрепляются к тле стилет в считанные секунды и может оставаться заразным от четырех до семнадцати часов.[26][27] Расстояние, на которое могут передаваться вирионы, ограничено из-за короткого периода, в течение которого они остаются заразными.[23] Хотя короткая продолжительность жизни вне растений препятствует передаче вируса на большие расстояния, это не снижает эффективность передачи, обеспечиваемую высокой скоростью приобретения вируса и инокуляции в поле.

При входе в растительную клетку белок оболочки вируса разбирает и выпускает РНК геном. Вирусная РНК служит мРНК, и хотя о его трансляции известно немного, считается, что некодирующая 5’-область функционирует как усилитель трансляции.[28] Транслируемая мРНК приводит к образованию полипротеина, который превращается в зрелые белки. Затем каждый полипротеин расщепляется на десять различных белков, которые считаются многофункциональными. Эти белки вместе с белками хозяина собираются в репликационный комплекс. Этот комплекс выполняет отрицательная прядь Синтез РНК с использованием положительной цепи вирусной РНК в качестве матрицы. После создания дополнительных копий РНК они кодируют синтез различных белков, как упоминалось ранее, а также белков оболочки. Эти белки оболочки теперь будут охватывать вновь сформированные геномы, чтобы дать начало новым вирионы. Было высказано предположение, что вложение вновь образованных вирионов инициируется взаимодействием белков оболочки с 5’-концом и что белок оболочки накапливается к 3’-концу.[29] Весь процесс репликации вируса происходит внутри эндоплазматический ретикулум. Эти вновь синтезированные вирусные частицы впоследствии транспортируются через плазмодесмы к соседним клеткам растений с помощью нескольких вспомогательных белков потивируса. Распространение вирусов внутри растения происходит в соответствии с соотношением источник-поглотитель между созревающими и растущими тканями.[30] Концентрация вируса по всему растению высока, и это значительно увеличивает вероятность поглощения тлей. Заражение растений потивирусами может иметь различные симптомы. Инфекция может включать некроз жилок, мозаичные симптомы, а также деформацию листьев (Boonham et al., 2002). Зараженные растения, которые не проявляют симптомов, могут иметь зараженный полог, и из них будет получаться продукция более низкого качества, чем их здоровые аналоги.

Картофель - PVYNTN взаимодействие

Начиная с PVYNTN вызывает большие потери в производстве картофеля, исследования картофеля - вирус картофеля YNTN взаимодействие важно. Чувствительные сорта картофеля реагируют на PVYNTN прививка с развитием типичных симптомов. На инокулированных листьях через 5-7 дней после инокуляции развиваются хлоротичные и некротические кольцевые пятна. По мере распространения вируса по растению на неинокулированных листьях развиваются системные симптомы. Через 10 дней после инокуляции появляются морщинки и мозаичный хлороз, что приводит к появлению пальмы (опадание листьев).

Механизмы вирусной защиты растений в первую очередь будут пытаться ограничить движение вируса. В противном случае он может попытаться вызвать гибель клеток в инфицированной ткани, тем самым предотвращая распространение вирионов.[31] Хотя точный механизм индукции заболевания потивирусами у растений неизвестен, известно, что эти вирусы вызывают значительное прекращение экспрессии гена хозяина во время репликации вируса.[32][33][34]

Физиологические изменения растений картофеля в ответ на PVYNTN инфекции интенсивно изучались. Было показано, что на ранних стадиях инфекции, то есть в первые 12 часов, гены, связанные с фотосинтезом, гены, участвующие в восприятии, передаче сигналов и защитной реакции, экспрессируются по-разному.[34] Через 24 ч после инокуляции количество салициловой кислоты увеличивалось.[35]

Нарушение экспрессии генов нарушает нормальную клеточную функцию клеток, что может быть причиной физических симптомов, которые демонстрирует растение. Во время развития симптомов исследования взаимодействия между восприимчивым сортом картофеля и PVYNTN показали изменения уровня цитокининов.[36] В инокулированных листьях проявляются изменения симптомов в структуре и размере хлоропластов,[37] более низкие уровни хлорофилла и дифференциальная активность растворимых и ионно связанных пероксидаз[38] были обнаружены.

На более поздних стадиях PVYNTN Концентрация общего белка инфекции увеличивалась у чувствительных сортов картофеля, тогда как у толерантных и умеренно толерантных сортов картофеля таких выраженных изменений не наблюдалось.[39] Исследования экспрессии генов выявили изменения в экспрессии генов белков теплового шока, каталазы, β-1,3-глюканазы и генов, участвующих в фотосинтезе.[33]

Молекулярное описание Картофельный вирус Y

Вирионы потивируса состоят из нитевидных структур без оболочки, длина которых составляет 680-900 нм, а ширина - 11-15 нм.[40] Морфологически потивирус капсид состоит примерно из 2000 экземпляров белок оболочки (CP).[30]

Капсид инкапсулирует одну цепь положительной смысловой РНК, которая имеет длину порядка 10 т.п.н. и имеет нетранслируемую 5’-концевую область (5’-NTR), а также 3’-поли-А хвост.[41][42] Геном с положительным смыслом содержит одну расширенную открытую рамку считывания и действует непосредственно как мРНК. 144 нуклеотид 5’-NTR особенно богат аденин остатки и очень мало гуанин остатки. В отличие от обычной кэп-структуры, 5’NTR связан с белком, связанным с вирусным геномом (VPg ), который, как говорят, действует как усилитель транскрипции.[28]

5’-лидерная последовательность имеет внутренний сайт входа рибосомы (IRES) и кэп-независимые регуляторные элементы трансляции (CIRE).[43] IRES управляет независимой от кэп трансляцией посредством механизма, аналогичного используемому эукариотами.[44] Расширенная открытая рамка считывания кодирует полипротеин 350 кДа. Этот полипротеин протеолитически процессируется вирусными протеазами (NIa, HC-Pro и P1) и подвергается ко- и посттрансляционному расщеплению с образованием нескольких многофункциональных белков. К ним относятся следующие: P1 (белок P1), HCPro (протеиназа вспомогательного компонента), P3 (белок P3), 6K1 (белок 1 6 кДа), CI (цилиндрическое включение), 6K2 (белок 2 6 кДа), VPg (Вирусный белок, связанный с геномом), NIaPro (ядерный белок включения a, протеиназный домен), NIb (ядерный белок включения b) и CP (белок оболочки).[30]

Диагностические методы обнаружения Картофельный вирус Y

ELISA

В прошлом посевы проверялись визуально, чтобы определить, свободны ли они от болезней. Визуальный осмотр также использовался в качестве основы для сертификации семян. Определить вирусный статус путем визуального осмотра невероятно сложно, поскольку симптомы могут быть замаскированы или инфекция скрыта.[23] В результате были введены послеродовые испытания и проверки. Эти испытания включали выращивание ранее собранного материала в теплицах. Полученные растения проверяли для более точной оценки вирусного статуса. Хотя этот метод скрининга действительно предлагал некоторую степень мониторинга вирусного присутствия, он был субъективным и крайне неэффективным. Иммуноферментный анализ (ELISA) скрининг посевов и семенного картофеля заменил визуальный осмотр в начале 1970-х годов. Использование ELISA дало рутинным диагностическим лабораториям быстрый, эффективный и чувствительный метод скрининга на широкий спектр вирусов растений картофеля.

Обнаружение патогенов с помощью ELISA зависит от взаимодействия между антигеном и специфическим антитела и стал популярным и экономичным средством повседневного обнаружения. В ELISA твердую фазу можно покрыть исследуемым образцом, содержащим антиген.[45] Эффективность связывания антигена с твердой фазой зависит от температуры, продолжительности воздействия, а также от концентрации.[45] Используемые твердые фазы включают нитроцеллюлозные мембраны, бумагу, стекло, агарозу и полистирол или поливинилхлоридные микротитровальные планшеты. Планшеты для микротитрования являются наиболее широко используемыми твердофазными планшетами, поскольку с ними легко обращаться, их можно автоматизировать и проводить анализ с использованием ридеров для микротитровальных планшетов. Недостатком этих планшетов является то, что они обладают высокой абсорбцией, и это увеличивает частоту неспецифического связывания компонентов, используемых в ELISA. Неспецифическое связывание с планшетами снижается за счет использования буферов, содержащих белки, такие как казеин, и неионогенные детергенты, такие как Tween 20. После нанесения покрытия избыток образца удаляется, и планшет обычно обрабатывается 1% раствором казеина. После этого твердую фазу обрабатывают антителами против интересующего антигена. После каждого этапа инкубации планшет промывают твином 20, содержащим PBS. Эти этапы промывки предназначены для смывания любых неспецифически связанных компонентов.[46] Неспецифически связанные компоненты связаны менее прочно, чем специфически связанные. Обнаружение достигается либо путем добавления антитела, связанного с ферментом, либо путем добавления и обнаружения биотинилированного антитела. В системе, в которой используется антитело, связанное с ферментом, последующее добавление соответствующего субстрата приводит к образованию цвета, пропорционального количеству антигена.[46] Альтернативно планшет может быть покрыт антителом с последующей инкубацией с образцом, который должен быть обнаружен. Это, в свою очередь, может быть обнаружено, как описано выше, и затем называется ELISA с двойным сэндвичем антител (DAS). Однако обе эти системы имеют недостаток, заключающийся в том, что связывание фермента с антителом может привести к стерическое препятствие что, в свою очередь, может привести к потере функции антитела и / или фермента.[47] Этого можно избежать с помощью биотин-авидинового или биотин-стрептавидинового мостика. В этом типе системы биотин связан с антителом. Молекула биотина не влияет на работу антител и легко обнаруживается с помощью авидина или стрептавидина, конъюгированных с подходящим ферментом. Стрептавидин имеет чрезвычайно высокое сродство к биотину, что приводит к даже более высокой степени специфичности, чем система, в которой фермент непосредственно связан с антигеном. Чтобы установить, присутствует ли антиген, добавляется субстрат, специфичный для используемого фермента. Затем фермент преобразует субстрат в окрашенный продукт, и интенсивность окраски может быть коррелирована с количеством связанных антител и, следовательно, с количеством присутствующего антигена. DAS-ELISA имеет то преимущество, что он может повысить специфичность ELISA и уменьшить возникновение неспецифического связывания. В результате принцип DAS-ELISA обычно используется в ELISA для обнаружения патогенов растений в соке растений без предварительной очистки патогена.

ELISA считается безопасным, недорогим и быстрым методом обнаружения вирусов растений. Его недорогой характер и относительная простота позволяют использовать его в качестве рабочей лошадки в сельскохозяйственном секторе и использовать для проверки тысяч образцов в год. К сожалению, ELISA не является полностью отказоустойчивым. Уровни вируса в клубнях картофеля, которые проверяются методом ELISA для использования в качестве семенного картофеля, обычно низкие, пока клубни находятся в состоянии покоя. Выявление вирусов в этом картофеле с помощью ELISA затруднено, и значения поглощения могут упасть ниже установленного порогового значения. По этой причине скрининг семенных клубней проводится на прорастающих, а не на спящих клубнях. Хотя это приводит к более надежным показаниям, чем прямое тестирование клубней, это задерживает сертификацию семенного картофеля.[48] Другой недостаток иммуно-основанного метода обнаружения состоит в том, что изменения на уровне гена могут влиять на иммуногенность обнаруживаемого антигена. Что касается вирусов растений картофеля, мутации в гене CP могут вызывать конформационные изменения CP, что делает антитела, продуцируемые против ранее присутствующего вируса, менее эффективными.

ОТ-ПЦР

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) стал мощным и эффективным методом обнаружения вирусов растений картофеля в растительном материале картофеля и даже в спящем картофеле. Для анализа с помощью ОТ-ПЦР требуется всего лишь небольшой кусочек растительного материала. С учетом протокола, описанного в этой диссертации, 0,1 г растительного материала достаточно для 14 500 отдельных реакций. Во время ОТ-ПЦР специфические последовательности целевой РНК экспоненциально амплифицируются в копии ДНК. Однако для того, чтобы это произошло, РНК вируса должна быть сначала транскрибирована в ДНК с помощью полимеразы обратной транскриптазы. Эта полимераза синтезирует цепь ДНК, используя РНК в качестве матрицы. Это приводит к комплексу ДНК / РНК. Для синтеза цепи ДНК из матрицы РНК требуется только обратный праймер, поскольку РНК представляет собой одну цепь, расположенную от 5 ’до 3’. Впоследствии вновь синтезированная цепь ДНК используется в качестве матрицы для традиционной ПЦР.

Доступны различные типы полимераз обратной транскриптазы, соответствующие различным потребностям и условиям реакции. Обычно используемые ферменты обратной транскриптазы включают AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript и Tth RT. В конце стадии RT полимеразный фермент активируется нагреванием. Также может быть, что полимераза обратной транскриптазы и ДНК-полимераза являются одним и тем же ферментом, и что фермент требует только стадии активации ДНК-полимеразы после стадии RT. Примером такого фермента является полимераза Tth. Этот фермент обладает как РНК-зависимой обратной транскриптазой, так и ДНК-зависимой полимеразной активностью. Однако активный центр ДНК-полимеразы покрыт выделенными олигонуклеотиды, называется аптамеры. При температурах ниже оптимальной температуры реакции ДНК-зависимый полимеразный компонент Tth остается покрытым аптамерами. При этих температурах фермент Tth синтезирует только ДНК-копию матрицы РНК. После повышения температуры реакции до 95 ° C аптамеры удаляются, и компонент ДНК-зависимой полимеразы начинает амплифицировать целевую последовательность.

ПЦР-амплификация ДНК-мишени происходит в три этапа: денатурация, отжиг и расширение.[46] Каждый из этих шагов происходит при определенной температуре в течение фиксированного периода времени. Денатурация обычно происходит при температуре от 90 до 95 ° C и приводит к диссоциации цепей ДНК. После этого реакционную смесь охлаждают до 40-70 ° C, чтобы грунтовки для связывания с их соответствующими целевыми последовательностями. Этот этап известен как этап отжига и зависит от праймера. Температура, при которой праймеры отжигаются, имеет решающее значение. Слишком высокие температуры не позволят праймерам связываться с ДНК, что приведет к отсутствию или плохой амплификации. Слишком низкая температура отжига в конечном итоге приведет к неспецифическому связыванию праймеров и неспецифической амплификации.[46] Праймеры, связанные с областями, фланкирующими ДНК-мишень, обеспечивают 3’-гидроксильные группы для удлинения, катализируемого ДНК-полимеразой. Наиболее часто используемая ДНК-полимераза - это Taq, термостабильный фермент, выделенный из термофильных бактерий, Thermus aquaticus. ДНК-полимераза синтезирует новые цепи ДНК вдоль цепей матрицы, используя праймеры в качестве отправных точек. На этапе удлинения цепи амплифицируются за пределы целевой ДНК. Это означает, что каждая вновь синтезированная цепь ДНК будет иметь область, комплементарную праймеру. Количество продуцируемой ДНК экспоненциально увеличивается, поскольку три вышеупомянутых шага повторяются циклически. В традиционной ПЦР эти шаги можно повторить от 20 до 55 раз. Однако проблема с амплификацией ПЦР состоит в том, что температура, необходимая для диссоциации цепи ДНК, также приводит к денатурации ДНК-полимеразы. Это частично преодолевается за счет биоинженерии полимераз, которые более термостабильны и имеют более длительный период полураспада.

Несмотря на то, что RT-PCR технически сложнее и дороже, чем ELISA, он позволяет обнаруживать низкие вирусные нагрузки. Считается, что RT-PCR в 102-105 раз более чувствительна, чем традиционный ELISA.[49] ОТ-ПЦР также позволяет обнаруживать несколько вирусных мишеней в одной и той же реакции за счет использования нескольких комбинаций праймеров. Это называется мультиплексированием. Хотя мультиплексирование технически более требовательно, чем традиционная симплексная реакция, оно обеспечивает более высокую пропускную способность, так как один образец может быть протестирован на несколько вирусных штаммов в одной реакции. Праймеры, используемые для мультиплексирования, выбираются таким образом, чтобы они давали ампликоны различного размера. Это позволяет проводить анализ после ОТ-ПЦР с использованием гель-электрофореза. Хотя RT-PCR экономит время, допускает мультиплексирование и более чувствителен, чем ELISA, необходимые реагенты и оборудование дороги и требуют более высокого уровня технических знаний. Кроме того, анализ конечного продукта с использованием гель-электрофореза трудоемок, относительно дороже, требует много времени и не поддается автоматизации. По этим причинам использование ОТ-ПЦР для рутинного скрининга нецелесообразно и не заменило ИФА. Однако это дает отрасли возможность выявить пограничные случаи, особенно в случае сертификации семенного картофеля.

Количественная ПЦР

В большинстве традиционных ПЦР полученные продукты анализируются после завершения ПЦР. Это называется анализом конечной точки и обычно носит качественный характер, а не количественный. Для такого рода анализа продукты в основном анализируются на агарозный гель и визуализированы с использованием этидиум бромид как флуоресцентный краситель. Прямая корреляция между силой сигнала и начальной концентрацией образца невозможна при использовании анализа конечной точки, поскольку эффективность ПЦР снижается по мере приближения реакции к фазе плато. Количественная ПЦР тем не менее, предлагает точную и быструю альтернативу традиционной ПЦР. Количественная ПЦР предлагает исследователю возможность усилить и проанализировать продукт в одной пробирке с использованием флуоресцентных красителей. Это известно как гомогенная ПЦР. Во время количественной ПЦР увеличение флуоресценции коррелирует с увеличением продукта. Благодаря использованию различных специфичных красителей количественная ПЦР может использоваться для различения различных штаммов вируса и даже для обнаружения точечных мутаций. Основное преимущество количественной ПЦР состоит в том, что не требуется анализ полученных продуктов с помощью гель-электрофореза. Это означает, что количественная ПЦР может быть реализована как высокопроизводительный метод скрининга образцов.

Количественная ПЦР описана для обнаружения[50] и дискриминация PVYО и PVYN изолирует[51][52] и для надежной дискриминации между PVYNTN и PVYN изолирует.[53]

Примечания и ссылки

  1. ^ а б Кутси, Дж. (2005). Virusse bedreig hele aartappelbedryf, Landbouweekblad, 61637: 44-45.
  2. ^ Уорд, К.В. и Шукла, Д.Д. (1991). Таксономия потивирусов: текущие проблемы и возможные решения. Intervirology, 32: 269-296.
  3. ^ Джавайд, А. Хан А. Дж. И Дейкстра Дж. (2002). Вирусы растений как молекулярные патогены. Пресса пищевых продуктов, The Haworth Press Inc., N.Y.
  4. ^ Макдональд, Дж. и Сингх Р.П. (1996). Диапазон хозяев, симптоматика и серология изолятов вируса Y картофеля (PVY), обладающих свойствами обоих вирусов PVY.N и PVYО группы штаммов. Амер. Горшок. J., 73: 309-314.
  5. ^ а б c d е Уоррен М., Крюгер К. и Шуман А.С. (2005). Вирус картофеля Y (PVY) и вирус скручивания листьев картофеля (PLRV): обзор литературы по картофелю в Южной Африке. Кафедра зоологии и энтомологии факультета естественных и сельскохозяйственных наук Университета Претории.
  6. ^ Дельгадо-Санчес, С. и Гроган, Р. (1970). Картофельный вирус Y. CMI / AAB Описание вирусов растений. 37: CMI / AAB, Кью, Суррей, Англия, 4 стр.
  7. ^ Саламан, Р. (1930). Вирусные болезни картофеля: Полоса. Природа, 126: 241.
  8. ^ Бланко-Ургоити, Б., Трибодет, М., Леклер, С., Понц, Ф., Перес де Сан Роман, К., Легорбуру, Ф.Дж. и Керлан, К. (1998). Характеристика изолятов картофельного потивируса y из партий семенного картофеля. Ситуация с изолятами NTN, Wilga и Z. Евро. J. Pl. Путь, 104: 811-819.
  9. ^ Visser, J.C., Rothmann, A.H., Bellstedt, D.U. (Не опубликовано). Оценка паттернов рекомбинации в южноафриканских штаммах вируса Y картофеля (PVY). Диплом с отличием.
  10. ^ Брант, А.А. (2001). Потивирусы. В: Loebenstein G., Berger, P.H., Brunt, A.A. и Лоусон, Р.Х. (ред.), Вирусы и вирусоподобные болезни картофеля и производство семенного картофеля. Kluwer Academic Publishers, Дордрехт, стр 77-86.
  11. ^ Де Боккс, Дж. А. (1981). CMI / AAB Описание вирусов растений. Potato virus Y. 37: 242. Загружено из всемирной сети: www.dpvweb.net/dprv/showdpv.php?dpvno=242
  12. ^ а б Смит, К. и Деннис, R.W.G. (1940)
  13. ^ Кросслин, Дж., Хэмм, П., Шил, П., Хейн, Д., Браун, К. и Бергер, П. (2005). Серологическое и молекулярное определение изолятов некроза жилок табака вируса Y картофеля (PVYN) из картофеля, выращенного на западе США. Амер. J. Pot. Res., 82: 263-269.
  14. ^ Бунхэм, Н., Уолш, К., Химс, М., Престон, С., Норт, Дж. И Баркер, И. (2002). Биологическое сравнение и сравнение последовательностей изолятов вируса Y картофеля, ассоциированных с некротической кольцевой болезнью клубней картофеля. Pl. Путь., 51: 117-126.
  15. ^ а б Бунхэм, Н., Уолш, К., Престон, С., Норт, Дж., Смит, П. и Баркер, И. (2002). Обнаружение некротических изолятов вируса Y картофеля и точное различение PVYО, PVYN и PVYC штаммы с помощью ОТ-ПЦР. J. Virol. Meth., 102: 103–112.
  16. ^ Лоренцен, Дж. Х., Мичем, Т., Бергер, П. Х., Шил, П. Дж., Кросслин, Дж. М., Хэмм, П. Б. и Копп, Х. (2006). Полногеномная характеристика изолятов вируса Y картофеля, собранных на западе США, и их сравнение с изолятами из Европы и Канады. Arch. Virol., 151: 1055-1074.
  17. ^ а б c Халберт, С.Е., Корсини, Д.Л. и Вибе, М.А. (2003). Эффективность передачи вируса Y картофеля для некоторых распространенных тлей в Айдахо. Амер. J. Pot. Res., 80: 87-91.
  18. ^ а б Рэдклифф, Э. и Рэгсдейл, Д.В. (2002). Вирусы картофеля, передаваемые тлей: важность понимания биологии переносчиков. Амер. J. Pot. Res. 79: 353-386.
  19. ^ а б Рэдклифф, Э. (1982). Насекомые-вредители картофеля. Анна. Р. Энто., 27: 173-204.
  20. ^ Рэгсдейл, Д.В., Рэдклифф, Э.Б., ДиФонцо, К.Д. (1994). Пороги действия для тли - переносчика вируса скручивания листьев картофеля, стр. 99-110. В: Zehnder, G.W., Powelson, M.L., Jansson, R.K. и Раман, К. [ред.], Достижения в биологии и борьбе с вредителями картофеля. Американское фитопатологическое общество, Миннесота, США.
  21. ^ а б Ван Хоф, Х.А. (1980). Тли-переносчики вируса картофеля YN. Нет. J. Pl. Путь, 86: 159.
  22. ^ Томпсон, Г.Дж. (1997). Изучение и борьба с вирусными болезнями картофеля. В: Landbounavorsingsraad Roodeplaat: Aartappelnavorsing 1996/1997. Совет сельскохозяйственных исследований, Претория.
  23. ^ а б c Роберт Ю., Вудфорд Дж. и Ducray-Bourdin, D.G. (2000). Некоторые эпидемиологические подходы к борьбе с вирусными болезнями, передаваемыми тлями, на посевах семенного картофеля в Северной Европе. Vir. Res. 71: 33-47.
  24. ^ Грей, С. (1996). Белки вирусов растений, участвующие в передаче естественных векторов. Trends Microbiol. 4: 259-264.
  25. ^ Брэдли, R.H.E. и Rideout, D.W. (1953). Сравнительная передача Картофельный вирус Y четырьмя видами тлей, поражающих картофель. Может. J. Zool., 31: 333-341.
  26. ^ Харрисон, Б. (1984). CMI / AAB Описание вирусов растений. Вирус скручивания листьев картофеля 291 (пересмотренный № 36). www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dvpno=291.
  27. ^ Костив, М. (1975). Исследование удержания вирусов картофеля M и Y у двух видов тлей (Myzus persicae Sulz. И Aphis nasturtii Kalt.). Горшок. Res., 18: 637–640.
  28. ^ а б Кэррингтон, Дж. К. и Фрид, Д. Д. (1990). Независимое от кэпа усиление трансляции 5’-нетранслируемой областью потивируса растений. J. Virol., 64: 1590-1597.
  29. ^ Ву, X и Шоу, J.G. (1998). Доказательства того, что сборка потивируса начинается около 5’-конца вирусной РНК. J. Gen. Virol., 79: 1525–1529.
  30. ^ а б c Талбот, Нью-Джерси (2004). Взаимодействие растений с патогенами. Блэквелл Паблишинг. CRC Press.
  31. ^ Багналл, Р. Х. и Брэдли Р. Х. Э. (1958). Устойчивость к вирусу Y картофеля. Фитопатология, 48: 61-120.
  32. ^ Бушелл, М. и Сарнов, П. (2002). Взлом аппарата трансляции РНК-вирусами. J. Cell Biol., 158: 395-399.
  33. ^ а б Помпе-Новак, М., Груден, К., Беблер, С., Кречич-Стрес, Х., Ковач, М., Йонгсма, М. и Равникар, М. (2006). Вирус Y картофеля вызывал изменения в экспрессии генов картофеля (Solanum tuberosum L.). Physio. и Мол. Pl Path., 67: 237-247.
  34. ^ а б Baebler Š, Krečič-Stres H, Rotter A, Kogovšek P, Cankar K, Kok EJ, Gruden K, Kovač M, el J, Pompe-Novak M, Ravnikar M, 2009. PVYNTN вызывает ответ на различную экспрессию генов в разных генотипах картофеля. в первые 12 ч после инокуляции. Мол завод Патол 10, 263-275.
  35. ^ Кречич-Стрес Х., Вучак С., Равникар М., Ковач М. 2005. Системный вирус картофеля YNTN инфекция и уровни салициловой и гентизиновой кислот у разных генотипов картофеля. Завод Патол, 54: 441-447
  36. ^ Dermastia M., Ravnikar M. 1996. Измененный цитокининовый образец и повышенная толерантность к вирусу Y картофеля.NTN в восприимчивом сорте картофеля (Solanum tuberosum L.), выращенном in vitro. Physiol Mol Plant P, 48: 65-71
  37. ^ Помпе-Новак М., Вришер М., Равникар М. 2001. Ультраструктура хлоропластов в листьях растений картофеля, инфицированных вирусом Y картофеля.NTN. Фитон, 41: 215-226.
  38. ^ Милавец М., Равникар М., Ковач М. 2001. Пероксидазы и фотосинтетические пигменты у восприимчивого картофеля, инфицированного вирусом картофеля YNTN. Физиол растений Биох 39: 891-898
  39. ^ Груден К., Штрукель Б., Равникар М., Херцог-Великонья Б. 2000. Предполагаемый белок, связанный с вириальной резистентностью, выделенный из сорта картофеля, устойчивого к PVY.NTN инфекционное заболевание. Фитон, 40: 191-200
  40. ^ Эдвардсон, Дж. Р. (1947). Некоторые свойства Y-группы вирусов картофеля. Серия монографий о сельскохозяйственных экспериментальных станциях Флориды, 4: 398.
  41. ^ Догерти, У. Г. и Кэррингтон, Дж. К. (1988). Экспрессия и функция продуктов потивирусных генов. Анну. Rev. Phytopathol., 26: 123-143.
  42. ^ Ван дер Влугт, Р., Аллефс, С., Де Хаан, П. и Гольдбах, Р. (1989). Нуклеотидная последовательность 3’-концевой области YN РНК вируса картофеля. J. Gen. Virol., 70: 229-233.
  43. ^ Даллер Б.Дж., Шарест П.Дж., Девантье Ю. и Лалиберте Ж.-Ф. (1994). Доказательства наличия внутреннего сайта входа в рибосомы в 5'-нетранслируемой области РНК потивируса мозаики репы. J. Gen. Virol., 75: 3157-3165.
  44. ^ Нипель М. и Галли Д. (1999). Идентификация и характеристика функциональных элементов в 5'-лидере вируса травления табака, необходимых для независимой от кэп трансляции. J. Gen. Virol., 79: 897-904.
  45. ^ а б Тейссен, П. (1985). Бурдон Р. Х. и Книппенберг П. Х. [ред.], Лабораторные методы в практике биохимии и молекулярной биологии и теория иммуноферментных анализов, том 15, Elsevier Science Publishers B.V., Амстердам.
  46. ^ а б c d Уилсон, К. и Уокер, Дж. (2000). Практическая биохимия: принципы и методы. (5-е изд). The Press Syndicate, Кембриджский университет, Кембридж, Великобритания.
  47. ^ Блейк, К. и Гулд, Б.Дж. (1984). Использование ферментов в иммуноферментных методах. Аналитик, 109: 533-547.
  48. ^ Гугерли П. и Геригер В. (1980). Иммуноферментный анализ (ELISA) для обнаружения вируса скручивания листьев картофеля и вируса Y картофеля в клубнях картофеля после искусственного нарушения покоя. Горшок. Res., 23: 353–359.
  49. ^ Мамфорд, Р.А., Фишер, Т., Элмор, Дж., Викерс, Д., Свон, Х., Уолш, К., Баркер, И. и Бунхэм, Н. (2004). Разработка рутинного метода прямого тестирования клубней в качестве быстрой и надежной альтернативы традиционному тестированию на приращение. 12-е заседание секции вирусологии EARP Ренн, Франция, 2004 г .: выдержки из устных презентаций и стендовые доклады. Имеется в наличии: http://www.rennes.inra.fr/eapr2004/abstracts.htm
  50. ^ Агиндотан, Б. О., Шил, П. Дж., Бергер, П. Х., 2007. Одновременное обнаружение вирусов картофеля, PLRV, PVA, PVX и PVY из покоящихся клубней картофеля с помощью TaqMan(Р) ОТ-ПЦР в реальном времени. J Virol методы 142, 1-9.
  51. ^ Бальме-Синибальди, В., Трибодет, М., Кройза, Ф., Лефевр, П., Керлан, К., Жако, Э., 2006. Улучшение обнаружения и количественного определения вируса Y картофеля (PVY) с использованием PVYN- и PVYO -специфические анализы ОТ-ПЦР в реальном времени. J. Virol Methods 134, 261-266.
  52. ^ Jacquot, E., Tribodet, M., Croizat, F., Balme-Sinibaldi, V., Kerlan, C., 2005. Методика на основе однонуклеотидного полиморфизма для специфической характеристики YО и YN изоляты вируса Y картофеля (PVY). Дж. Вирол Методы 125, 83-93.
  53. ^ Коговшек, П., Гоу, Л., Помпе-Новак, М., Груден, К., Фостер, Г.Д., Бунхэм, Н., Равникар, М., 2008. Одношаговая RT-ПЦР в реальном времени для чувствительного обнаружения и дискриминация изолятов вируса Y картофеля. Дж. Вирол Методы 149, 1-11.

внешняя ссылка