Иммуноцитохимия - Immunocytochemistry

Иммуноцитохимия маркирует отдельные белки внутри клеток, такие как TH (зеленый) в аксоны сочувствующего автономный нейроны.

Иммуноцитохимия (ICC) является обычным лабораторная техника который используется для анатомической визуализации локализации определенного белка или антиген в ячейках с помощью специального первичное антитело что привязано к нему. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентный микроскоп когда он связан вторичное антитело который имеет сопряженный флуорофор. ICC позволяет исследователям оценить, действительно ли клетки в конкретном образце выражать антиген[1] обсуждаемый. В случаях, когда иммунопозитивный сигнал обнаружен, ICC также позволяет исследователям определить, какие субклеточные отсеки экспрессируют антиген.

Иммуноцитохимия против иммуноhistoхимия

Иммуноцитохимия отличается от иммуногистохимия[2] в том, что первое выполняется на образцы неповрежденных клеток, которые имели большую часть, если не все, окружающие их внеклеточный матрикс удаленный.[нужна цитата ] Сюда входят отдельные ячейки, которые были изолированные из блока твердой ткани клетки, выросшие в культура, клетки депонированы из приостановка, или клетки, взятые из мазок. Напротив, иммуногистохимические образцы представляют собой срезы биологическая ткань, где каждая клетка окружена тканевой архитектурой и другими клетками, которые обычно находятся в неповрежденной ткани. Иммуноцитохимия - это метод, используемый для оценки присутствия определенного белка или антигена в клетках (культивируемых клетках, клеточных суспензиях) с помощью специфических антител. который связывается с ним, что позволяет визуализировать и исследовать под микроскопом. Это ценный инструмент для определения клеточного содержимого отдельных клеток. Образцы, которые можно проанализировать, включают мазки крови, аспираты, мазки, культивированные клетки и клеточные суспензии.

Есть много способов подготовить образцы клеток для иммуноцитохимического анализа. У каждого метода есть свои сильные стороны и уникальные характеристики, поэтому можно выбрать правильный метод для желаемой выборки и результата.

Клетки, подлежащие окрашиванию, можно прикрепить к твердой подложке, чтобы облегчить использование в последующих процедурах. Этого можно добиться несколькими способами: прилипшие клетки можно выращивать на предметных стеклах микроскопа, покровных стеклах или на оптически подходящей пластиковой подложке. Клетки суспензии можно центрифугировать на предметных стеклах (цитоспин ), связанные с твердой подложкой с помощью химических линкеров или в некоторых случаях обрабатываемые в суспензии.

Концентрированные клеточные суспензии, существующие в среде с низкой вязкостью, являются хорошими кандидатами для приготовления мазков. Разбавленные суспензии клеток, существующие в разбавленной среде, лучше всего подходят для получения цитоспинов путем цитоцентрифугирования. Суспензии клеток, существующие в среде с высокой вязкостью, лучше всего подходят для тестирования в качестве препаратов мазков. Постоянным среди этих препаратов является то, что вся клетка присутствует на поверхности предметного стекла. Для того, чтобы произошла какая-либо межклеточная реакция, иммуноглобулин должен сначала пройти через клеточную мембрану, которая не повреждена в этих препаратах. Реакции, происходящие в ядре, могут быть более сложными, а внеклеточные жидкости могут создавать уникальные препятствия для выполнения иммуноцитохимии. В этой ситуации становится необходимым повышение проницаемости клеток с помощью детергента (Triton X-100 или Tween-20) или выбора органических фиксаторов (ацетон, метанол или этанол).

Антитела - важный инструмент для демонстрации как наличия, так и субклеточной локализации антигена. Окрашивание клеток - это очень универсальный метод, и, если антиген сильно локализован, он может обнаружить всего лишь тысячу молекул антигена в клетке. В некоторых случаях окрашивание клеток также может использоваться для определения приблизительной концентрации антигена, особенно с помощью анализатора изображений.

Методы

Дополнительная информация об иммунохимических методах: Иммуногистохимия

Существует множество методов иммунологического обнаружения тканей, включая методы, непосредственно связанные с первичными антителами или антисыворотками. Прямой метод включает использование обнаруживаемой метки (например, флуоресцентной молекулы, частиц золота и т. Д.) Непосредственно на антителе.[3] которому затем позволяют связываться с антигеном (например, белком) в клетке.

Как вариант, есть много косвенные методы. В одном из таких методов антиген связывается с первичным антителом, которое затем амплифицируется с использованием вторичное антитело который связывается с первичным антителом. Затем наносится третичный реагент, содержащий ферментативный фрагмент, который связывается со вторичным антителом. Когда применяется четвертичный реагент или субстрат, ферментативный конец третичного реагента превращает субстрат в продукт реакции пигмента, который дает цвет (возможны многие цвета; коричневый, черный, красный и т. Д.) В том же самом место, где исходное первичное антитело распознало интересующий антиген.

Некоторые примеры субстраты используются (также известные как хромогены): AEC (3-амино-9-этилкарбазол) или DAB (3,3'-диаминобензидин ). Использование одного из этих реагентов после воздействия необходимого фермента (например, пероксидазы хрена, конъюгированной с реагентом антител) дает положительный продукт иммунореакции. Иммуноцитохимическая визуализация конкретных представляющих интерес антигенов может использоваться, когда менее специфическое окрашивание, такое как H&E (гематоксилин и эозин), не может быть использовано для постановки диагноза или для предоставления дополнительной прогностической информации относительно лечения (например, при некоторых формах рака).

Альтернативно вторичное антитело может быть ковалентно связано с флуорофор (FITC и Родамин являются наиболее распространенными), которые обнаруживаются с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа. Местоположение флуоресценции будет варьироваться в зависимости от молекулы-мишени, внешнее для мембранных белков и внутреннее для цитоплазматических белков. Таким образом иммунофлуоресценция это мощная техника в сочетании с конфокальная микроскопия для изучения расположения белков и динамических процессов (экзоцитоз, эндоцитоз, так далее.).

Рекомендации

  1. ^ У. Берри, Ричард (2010). Иммуноцитохимия. Спрингер, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. стр.7 –16. ISBN  978-1-4419-1304-3.
  2. ^ Реншоу, Саймон (2017). Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: основные методы, второе издание. John Wiley & Sons, Ltd., стр. 35–102.
  3. ^ Купер, Марк; Луммас, Шериден (2016). Иммуногистохимия и иммуноцитохимия: основные методы, второе издание. John Wiley & Sons, Ltd., стр. 21–23.

внешняя ссылка