Лизат амебоцитов Limulus - Limulus amebocyte lysate

Лизат амебоцитов Limulus (LAL) представляет собой водный экстракт клеток крови (амебоциты ) от Атлантический подковообразный краб Лимулус полифем. LAL реагирует с бактериальным эндотоксин липополисахарид (LPS), который является мембрана компонент грамотрицательные бактерии. Эта реакция лежит в основе LAL тест, который широко используется для обнаружения и количественного определения бактериальные эндотоксины.

В Азии аналогичный Лизат амебоцитов тахиплеуса (TAL) тест на местных подковообразных крабах Тахиплеус гигантский или Tachypleus tridentatus иногда используется вместо этого.[1] В рекомбинантный фактор C (rFC) анализ представляет собой замена LAL / TAL на основе аналогичной реакции.[2]

Задний план

Фред Банг сообщил в 1956 году, что грамотрицательные бактерии, даже если их убить, превратят кровь подковообразного краба в полутвердую массу. Позже было установлено, что клетки крови животного, подвижные клетки, называемые амебоциты, содержат гранулы с фактор свертывания известный как коагулоген; он высвобождается за пределы клетки при обнаружении бактериального эндотоксина. Результирующий коагуляция (гелеобразование), как полагают, содержит бактериальные инфекции в полузакрытых сердечно-сосудистая система.[3] Современный анализ лизата привел к пониманию этой каскадной системы, в которой несколько ферментов работают последовательно для получения геля. Точкой входа для свертывания, вызванного эндотоксином, является фактор свертывания крови Limulus C.[4]

В 1977 г. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило LAL для тестирования лекарств, продуктов и устройств, контактирующих с кровью. До этой даты гораздо медленнее и дороже тест на кроликах был использован для этой цели.[5]

Собирают подковообразных крабов и удаляют кровь из подковообразных крабов. перикард; крабов возвращают в воду. Производители LAL измерили уровень смертности обескровленных крабов на уровне 3%; однако недавние исследования показывают, что это число может быть ближе к 15%.[6] или даже 30%.[7] Клетки крови отделяются от сыворотки с помощью центрифугирование и затем помещаются в дистиллированную воду, что приводит к их разбуханию и разрыву («лизированию»). Это высвобождает химические вещества изнутри клетки («лизат»), который затем очищается и лиофилизированный. Чтобы проверить образец на эндотоксины, его смешивают с лизатом и водой; эндотоксины присутствуют, если происходит коагуляция.[8]

LAL тест

Существует три основных метода: гель-сгусток, турбидиметрический и хромогенный. Основное применение LAL - это тестирование парентеральный фармацевтические препараты и медицинские устройства, которые контактируют кровь или спинномозговая жидкость. В США FDA опубликовало руководство по валидации теста LAL как теста на эндотоксин для таких продуктов.[9]

LAL каскад также запускается (1,3) -β-D-глюкан, через другой фактор G. И бактериальные эндотоксины, и (1,3) -β-D-глюкан считаются патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, или PAMPs, вещества, которые вызывают воспалительные реакции в млекопитающие.[10]

Преодоление торможения и усиления

Один из наиболее трудоемких аспектов тестирования эндотоксинов с использованием LAL - это предварительная обработка образцов для преодоления ингибирования анализа, которое может помешать тесту LAL, так что это влияет на восстановление эндотоксина. Если тестируемый продукт вызывает меньшее извлечение эндотоксина, чем ожидалось, продукт ингибирует тест LAL. Продукты, которые вызывают более высокие, чем ожидалось, значения, улучшаются. Преодоление ингибирующих и усиливающих свойств продукта требуется FDA как часть валидации теста LAL для использования в окончательном тестировании выпуска инъекционных препаратов и медицинских устройств. Правильное восстановление эндотоксинов должно быть доказано, прежде чем LAL можно будет использовать для выпуска продукта.[11]

Альтернативы

Рекомбинантный фактор C

Смотрите также: Атлантический подковообразный краб § Сохранение и управление

LAL-тест является основным источником продукт животного происхождения зависимость в биомедицинской промышленности, и с сообщениями о более высоком, чем ожидалось, уровне смертности, было сочтено более этичным разработать альтернативы тесту. (Идея о том, что отказ от LAL для сокращения использования атлантических подковообразных крабов поможет усилия по сохранению следует тщательно оценивать, так как переход на rFC может привести к обратным результатам, поставив под угрозу усилия по сохранению, которые многие пытались реализовать.) С 2003 года коммерчески доступен синтетический заменитель теста LAL. Назвал рекомбинантный фактор C (rFC), он основан на том же Фактор свертывания Limulus C белок, продуцируемый генетически модифицированными организмами, такими как клетки кишечника насекомых. (Конкретная используемая последовательность фактора C не обязательно происходит от атлантического подковообразного краба.)[5]

Вместо имитации всего процесса свертывания крови, тесты rFC позволяют фактору C расщеплять флуорогенную молекулу, так что образец загорается, когда эндотоксин активирует фактор. Поскольку он не содержит фактора G, (1,3) -β-D-глюкан не вызывает ложные срабатывания. По состоянию на 2018 год имеющиеся данные показывают, что тест rFC не хуже, чем тест LAL.[12]

Принятие теста rFC шло медленно, и ситуация начала меняться в 2012 году, когда FDA США и европейское министерство здравоохранения признали его приемлемой альтернативой. Отсутствие упоминания о нем в Фармакопеях оставалось проблемой, поскольку не существовало хорошего стандарта для запуска теста в производственной среде.[12] В 2016 году он был добавлен в Европейская Фармакопея.[5] Патент на RFC также ограничил применение до истечения срока его действия в 2018 году.[12]

1 июняул, 2020, Фармакопея США (USP) решила отменить предложение о включении рекомбинантной технологии для тестирования эндотоксинов в главу <85> Бактериальные эндотоксины и начать разработку отдельной главы, которая расширяет использование, валидацию и сопоставимость тестов на эндотоксины. на основе рекомбинантно полученных реагентов. Отдельная глава 1085.1 будет только руководящей главой, то есть rFC не будет компендиальным методом. Глава 1085.1 Фармакопеи США потребует, чтобы пользователь rFC провел валидацию альтернативных микробиологических методов, как подробно описано в главе <1223> Фармакопеи США, если они хотят внедрить rFC.[13]

Тест активации моноцитов

В тест активации моноцитов (MAT) - еще один предлагаемый метод тестирования на эндотоксины на основе моноциты в человеческая кровь. Он измеряет выпуск цитокины из них из-за наличия пирогены, в основном отражая процесс, с помощью которого эти токсины вызывают лихорадку у людей.[14] Протокол теста MAT с использованием культивированных клеток описан в Европейской фармакопее.[15]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Шэн Дж, Чжоу Дж, Пэн Й, Чжу З, Чэнь Л. (1 января 2006 г.). «Тест на лизат тахиплеуса амебоцитов с использованием в реакции на переливание». Китайский журнал нозокомиологии (на китайском языке).
  2. ^ "Производители и консервация эндотоксинов". www.horseshoecrab.org. Получено 10 марта 2020.
  3. ^ Грир С. "Фредерик Банг". Школа общественного здравоохранения JH Bloomberg. Школа общественного здравоохранения Bloomberg Джонса Хопкинса.
  4. ^ Иванага С. (май 2007 г.). «Биохимический принцип теста Limulus для определения бактериальных эндотоксинов». Труды Японской академии. Серия B, Физические и биологические науки. 83 (4): 110–9. Дои:10.2183 / pjab.83.110. ЧВК  3756735. PMID  24019589.
  5. ^ а б c Чжан С (09.05.2018). «Последние дни урожая голубой крови». Атлантический океан. Получено 2018-05-15.
  6. ^ «Катастрофа: повесть о двух видах - преимущества голубой крови». PBS. 10 июня 2008 г.
  7. ^ Leschen AS, Correia SJ (март 2010 г.). «Смертность самок подковообразных крабов (Limulus polyphemus) в результате биомедицинского кровотечения и обработки: последствия для управления рыболовством» (PDF). Поведение и физиология в морской и пресноводной среде. 43 (2): 135–47. Дои:10.1080/10236241003786873. S2CID  35152647. Архивировано из оригинал (PDF) на 14.06.2010.
  8. ^ «История Limulus и эндотоксина». Морская биологическая лаборатория. Архивировано из оригинал на 2008-10-28.
  9. ^ «Руководство для промышленности: Тестирование на пирогены и эндотоксины: вопросы и ответы». Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Получено 5 марта 2019.
  10. ^ Sandle T (август 2013 г.). «Примеси фармацевтического продукта: с учетом бета-глюканов». Американский фармацевтический обзор. 16 (5 Приложение S1): 16–19.
  11. ^ Уильямс К.Л., изд. (2007). Эндотоксины пирогены, LAL-тестирование и депирогенизация (3-е изд.). Нью-Йорк: Informa Healthcare. п. 342. ISBN  978-1420020595. Получено 7 марта 2015. Прежде чем использовать LAL для выпуска продукта, необходимо доказать надлежащее восстановление эндотоксинов.
  12. ^ а б c Мэлони Т., Фелан Р., Симмонс Н. (октябрь 2018 г.). «Спасение подковообразного краба: синтетическая альтернатива крови подковообразного краба для обнаружения эндотоксинов». PLOS Биология. 16 (10): e2006607. Дои:10.1371 / journal.pbio.2006607. ЧВК  6200278. PMID  30312293.
  13. ^ https://www.uspnf.com/notices/bacterial-endotoxin-test-gen-announcement-20200529
  14. ^ «Альтернативные методы тестирования эндотоксинов». www.horseshoecrab.org.
  15. ^ «Тест активации моноцитов: от валидации до лабораторного тестирования GMP». Американский фармацевтический обзор.

внешние ссылки