Депирогенизация - Depyrogenation

Депирогенизация относится к удалению пирогенов из раствора, чаще всего из инъекционных фармацевтических препаратов.

А пироген определяется как любое вещество, которое может вызвать жар. Бактериальные пирогены включают: эндотоксины и экзотоксины, хотя многие пирогены являются эндогенными для хозяина. Эндотоксины включают липополисахарид (LPS) молекулы, обнаруженные как часть клеточной стенки Грамотрицательный бактерии, и высвобождаются на бактериальную клетку лизис. Эндотоксины могут стать пирогенными при попадании в кровоток или другие ткани, где они обычно не обнаруживаются. Хотя толстая кишка в большом количестве содержит грамотрицательные бактерии, они не вызывают пирогенного эффекта, так как бактерии не подвергаются сильному лизису, а иммунная система не подвергается воздействию свободного эндотоксина, пока стенка толстой кишки не повреждена.

Когда LPS высвобождается при лизисе бактериальных клеток, липидный компонент A сначала связывается сывороточным LPS-связывающим белком (LBP), а затем переносится на CD14 (либо свободный CD14 в сыворотке, либо связанный с клеточной поверхностью макрофагов или моноцитов). Это мономеризует агрегированный ЛПС, поскольку Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) рецептора ЛПС не может распознавать ЛПС во время агрегирования. Затем мономерный ЛПС переносится в MD-2, предварительно комплексированный с TLR4 на макрофаги и моноциты. Это приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов и оксида азота, что в конечном итоге может привести к септическому шоку в зависимости от силы реакции. Сосудистый эндотелиальный клетки также экспрессируют TLR4 и MD-2 и, таким образом, напрямую реагируют на LPS, а также через цитокины и оксид азота. Клетки бронхиального эпителия и эпителиальные клетки толстой кишки также экспрессируют TLR4, но, поскольку они не экспрессируют MD-2, они полагаются на LPS, предварительно комплексированный с сывороткой MD-2, чтобы передать сигнал LPS.

Максимально допустимый уровень эндотоксина

Поскольку молекулярная масса эндотоксина может сильно различаться (от 10 000 до 1 000 000 Да), уровни эндотоксина измеряются в «единицах эндотоксина» (ЕС). Один EU приблизительно эквивалентен 100 пг липополисахарида E. coli - количество, присутствующее примерно в 105 бактерии. У людей могут развиться симптомы при воздействии всего лишь 5 EU / кг массы тела. Эти симптомы включают, помимо прочего, лихорадку, низкое кровяное давление, учащенное сердцебиение и низкий диурез; и даже небольшие дозы эндотоксина в кровотоке часто смертельны.

Соединенные Штаты Управление по контролю за продуктами и лекарствами установил следующие максимально допустимые уровни эндотоксина для лекарств, распространяемых в США:

  • Препарат (инъекционный, интратекальный ) - 0,2 ЕЭ / кг массы тела
  • Препарат (инъекционный, не интратекальный) - 5 ЕС / кг массы тела.
  • Стерильная вода - 0,25-0,5 ЕЭ / мл (в зависимости от предполагаемого использования)

Обнаружение пирогенов

Кролик Тест

Раннее обнаружение эндотоксина было достигнуто путем введения кроликам образца и наблюдения за реакцией по температуре их тела. Кролики имеют такую ​​же толерантность к эндотоксинам, что и люди, и поэтому были идеальным выбором. Однако этот метод был дорогостоящим, занимал много времени и вызвал протесты защитников прав животных. Но, возможно, самым большим недостатком этого теста была невозможность количественно определить уровень эндотоксина.

LAL тест

Основная статья: Лизат амебоцитов Limulus

В настоящее время одним из распространенных методов обнаружения эндотоксинов является Лизат амебоцитов Limulus (LAL) тест. Этот тест основан на наблюдении доктора Фредерика Банга о том, что в крови подковообразного краба образуются сгустки при воздействии эндотоксинов.[1] Экстракт амебоцитов из крови подковообразного краба смешивают с образцом, подозреваемым на контаминацию эндотоксинами, и при наличии эндотоксинов наблюдается реакция. FDA одобрило четыре варианта теста LAL: гель-сгусток, турбидиметрический, колориметрический и хромогенный анализ. Различия в этих вариациях относятся к характеристикам реакции амебоцитов / эндотоксина (например, гель-сгусток образует осадок, а колориметрические параметры меняют цвет). Этот тест является быстрым (около 30 минут) и высокочувствительным (чувствительность до 0,001 EU / мл). Однако, поскольку он обнаруживает только эндотоксины LPS, некоторые пирогенные материалы могут быть пропущены. Кроме того, определенные условия (неоптимальные условия pH или неподходящие катион концентрация) может привести к ложноотрицательным результатам. Глюканы матрица углеводной хроматографии также может привести к ложноположительным результатам.[2]

С 2003 года коммерчески доступен синтетический заменитель теста LAL. Этот тест на рекомбинантный фактор C (rFC) основан на Фактор свертывания Limulus C, LPS-чувствительная часть LAL. Принятие этого теста было медленным, и ситуация начала меняться в 2016 году, когда Европейская фармакопея перечислил этот тест как принятый тест на бактериальный токсин.[3]

Тест активации моноцитов

В Тест активации моноцитов (MAT) использует моноциты в человеческой крови in vitro для обнаружения пирогенов. Он был добавлен в Европейскую фармакопею в 2010 году и принят FDA в 2012 году.[4]

Удаление пирогенов (депирогенизация)

Часто бывает трудно удалить пирогены из раствора из-за большой изменчивости их молекулярной массы. Пирогены также относительно термически стабильны и нечувствительны к изменениям pH. Однако существует несколько методов удаления.[5]

Ионообменная хроматография
Эндотоксины заряжены отрицательно и связываются с анионообменник. Если целевое вещество также не заряжено отрицательно, оно пройдет через колонку раньше эндотоксина, и может быть достигнуто эффективное разделение. Этот метод иногда используется для очистки альбумины (подробности следуют). Лиганды с известным сродством к эндотоксинам может быть присоединен к системе анионного обмена для увеличения силы связывания эндотоксина и дальнейшего улучшения чистоты конечного продукта. Типичные примеры лигандов, связывающих эндотоксин, включают: гистамин, азотсодержащие гетероциклические соединения, и полимиксин B. Тем не мение, полимиксин B известно, что он индуцирует выработку интерлейкина-1, экзогенного пирогена, и, следовательно, необходимо показать его отсутствие в конечном продукте, если он используется.
Пример использования анионообменная хроматография для очистки альбумина:[6]
  • 2% эндотоксина не привязать к столбцу. Однако эти 2% вымываются до пика альбумина и, таким образом, могут быть удалены, просто начав сбор после того, как эти 2% вымываются.
  • 10% эндотоксина, который делает связывание с колонкой (9,8% от исходной суммы) в конечном итоге вымывается после пика альбумина. Это можно предотвратить попаданием в конечный продукт, остановив сбор до того, как это произойдет.
  • Оставшиеся 90% связанного эндотоксина (88,2% от исходной суммы) необходимо удалить с колонки с помощью NaOH.
Альтернативой анионному обмену является катионный обмен хроматография, в котором положительно заряженные растворенные вещества связываются с твердой хроматографической средой. В этом методе мишень связывается с колонкой вместо эндотоксина. Затем эндотоксин промывает колонку, и чистая мишень позже элюируется из колонки. Было показано, что катионообменная хроматография эффективно очищает β-интерферон. (Дембинский и др.)[7]
Ультрафильтрация
Поскольку молекулярная масса эндотоксинов обычно превышает 10 кДа, иногда можно использовать ультрафильтрацию для разделения по размеру. Из-за большой изменчивости размера эндотоксина может быть трудно выбрать правильную мембрану, поэтому этот метод лучше всего использовать только тогда, когда все присутствующие эндотоксины превышают 300000 Да. Было показано, что коммерчески доступные ультрафильтры удаляют пирогены до уровня ниже 0,001 EU / мл.[нужна цитата ]
Дистилляция
Этот метод также основан на большой молекулярной массе и термостабильности эндотоксинов. Растворители с низким молекулярным весом можно легко очистить путем кипячения и сбора конденсированного пара в сосуде, свободном от эндотоксинов (см. «Нагревание» ниже). Большие молекулы ЛПС нелегко испаряться, и поэтому они остаются в нагревательной емкости. Это предпочтительный метод очистки воды.

Инактивация / уничтожение

Поскольку пирогены часто трудно удалить, иногда может быть предпочтительна инактивация или разрушение молекулы LPS.

Кислотно-основной гидролиз
Было показано, что этот метод отщепляет липид А от полисахарида в молекуле LPS (см. Справа). В липид одна только часть не растворяется в воде. Таким образом, невозможно привязать к эндотелиальный ячейки, он становится неактивным. Однако кислотно-щелочной гидролиз может денатурировать целевой белок и, таким образом, не подходит для очистки белка.
Окисление
Окисление с использованием перекиси водорода часто используется как дешевый раствор для разрушения пирогена. Механизм этого разрушения неизвестен, но перекись водорода может быть легко удалена дальше по потоку в процессе очистки и, следовательно, является полезным методом удаления пирогена. Однако, как и кислотно-щелочной гидролиз, он не подходит для очистки белков.
Обогрев
Часто используются методы нагрева, чтобы гарантировать, что стекло и другое лабораторное оборудование не содержат пирогенных материалов. Нагревание осуществляется путем запекания в духовке с сухим жаром, которая разработана специально для процесса депирогенизации. Хотя эндотоксины относительно термически стабильны, достаточное нагревание (250 ° C в течение 30 минут) приводит к 3-логарифмическое сокращение уровней эндотоксина. Из-за высоких температур этот метод также не подходит для очистки белков.
Едкий натр
При очистке белков можно безопасно и эффективно использовать гидроксид натрия (NaOH). Он также широко используется для депирогенизации неавтоклавируемого оборудования (например, пластиков) и хроматографических колонок. Фактически, при использовании анионообменника для удаления пирогенов необходимо очищать колонку с помощью NaOH после каждой партии.

Профилактические методы

Поскольку практически все сырьевые материалы, задействованные в производственном процессе, включая сотрудников фабрики, могут быть потенциальными источниками пирогенного загрязнения, скрининг сырья и депирогенизация часто могут иметь большое значение для обеспечения того, чтобы конечный продукт не содержал пирогенов и не требовал дорогостоящего удаления или методы инактивации. Ультрафильтрация химикатов и буферных растворов, соблюдение соответствующих гигиенических норм и регулярные тесты могут оказаться полезными.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Грир, Спенсер; Здоровье, Школа общественности JH Bloomberg. "Фредерик Банг". Школа общественного здравоохранения Bloomberg Джонса Хопкинса.
  2. ^ [Сандл, Т. (2013). Примеси фармацевтического продукта: учитывая бета-глюканы, American Pharmaceutical Review, 16 (5) Дополнение S1: 16-19]
  3. ^ Мэлони, Том; Фелан, Райан; Симмонс, Наира (12 октября 2018 г.). «Спасение подковообразного краба: синтетическая альтернатива крови подковообразного краба для обнаружения эндотоксинов». PLOS Биология. 16 (10): e2006607. Дои:10.1371 / journal.pbio.2006607.
  4. ^ Руководство по промышленному тестированию на пирогены и эндотоксины: вопросы и ответы, FDA, июнь 2012 г.
  5. ^ Сэндл, Тим (октябрь 2011 г.). «Практический подход к исследованиям депирогенизации с использованием бактериального эндотоксина». Журнал соответствия GXP. 15 (4).
  6. ^ Хроматографическое удаление эндотоксинов и / или этанола из альбумина. Примечание по применению 206. Pharmacia Biotech., Упсала, 1990.
  7. ^ Дембинский, В .; O'Malley, J.A .; Сулковски, Э. Процедура крупномасштабной очистки интерферона фибробластов человека. Научные меморандумы по интерферону, Январь / февраль, 6 (1983).