Флуоресцентная спектроскопия - Fluorescence spectroscopy

Анализатор атомно-флуоресцентной спектроскопии для определения Меркурий

Флуоресцентная спектроскопия (также известен как флуориметрия или же спектрофлуориметрия) является разновидностью электромагнитная спектроскопия это анализирует флуоресценция по образцу. Это предполагает использование луча света, обычно ультрафиолетовый свет, который возбуждает электроны в молекулы определенных соединений и заставляет их излучать свет; обычно, но не обязательно, видимый свет. Дополнительная техника абсорбционная спектроскопия. В частном случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул флуктуации интенсивности излучаемого света измеряются либо от отдельных флуорофоров, либо от пар флуорофоров.

Устройства для измерения флуоресценции называются флуорометры.

Теория

Основная статья: Флуоресценция

Молекулы имеют различные состояния, называемые уровни энергии. Флуоресцентная спектроскопия в первую очередь занимается изучением электронных и колебательных состояний. Как правило, исследуемый вид имеет основное электронное состояние (состояние с низкой энергией), представляющее интерес, и возбужденное электронное состояние с более высокой энергией. В каждом из этих электронных состояний существуют различные колебательные состояния.[1]

При флуоресценции вид сначала возбуждается, поглощая фотон, из основного электронного состояния в одно из различных колебательных состояний в возбужденном электронном состоянии. Столкновения с другими молекулами заставляют возбужденную молекулу терять колебательную энергию, пока она не достигнет самого низкого колебательного состояния из возбужденного электронного состояния. Этот процесс часто визуализируется с помощью Диаграмма Яблонского.[1]

Затем молекула снова опускается на один из различных колебательных уровней основного электронного состояния, при этом испуская фотон.[1] Поскольку молекулы могут опуститься на любой из нескольких колебательных уровней в основном состоянии, испускаемые фотоны будут иметь разные энергии и, следовательно, частоты. Следовательно, анализируя различные частоты света, излучаемого при флуоресцентной спектроскопии, наряду с их относительной интенсивностью, можно определить структуру различных колебательных уровней.

Для атомарных видов процесс аналогичен; однако, поскольку разновидности атомов не имеют уровней колебательной энергии, испускаемые фотоны часто имеют ту же длину волны, что и падающее излучение. Этот процесс переизлучения поглощенного фотона является «резонансной флуоресценцией», и хотя он характерен для атомной флуоресценции, он также наблюдается в молекулярной флуоресценции.[2]

При типичном измерении флуоресценции (эмиссии) длина волны возбуждения является фиксированной, а длина волны обнаружения изменяется, тогда как при измерении возбуждения флуоресценции длина волны обнаружения фиксируется, а длина волны возбуждения изменяется в интересующей области. An карта выбросов измеряется путем регистрации спектров излучения, возникающих в результате диапазона длин волн возбуждения, и их объединения всех вместе. Это трехмерный набор данных о поверхности: интенсивность излучения в зависимости от длины волны возбуждения и излучения, который обычно изображается в виде контурной карты.

Приборы

Существуют два основных типа инструментов: фильтр-флуориметры которые используют фильтры для изоляции инцидент свет и флуоресцентный свет и спектрофлуориметры которые используют дифракционная решетка монохроматоры чтобы изолировать падающий свет и люминесцентный свет.

Оба типа используют следующую схему: свет от источника возбуждения проходит через фильтр или монохроматор и попадает на образец. Часть падающего света поглощается образцом, а некоторые молекулы в образце флуоресцируют. Флуоресцентный свет излучается во всех направлениях. Часть этого флуоресцентного света проходит через второй фильтр или монохроматор и достигает детектора, который обычно помещается под углом 90 ° к падающему световому лучу, чтобы минимизировать риск попадания проходящего или отраженного падающего света на детектор.

Упрощенный дизайн компонентов флуориметра

В качестве источников возбуждения могут использоваться различные источники света, включая лазеры, светодиоды и лампы; ксеноновые дуги и ртутные лампы особенно. Лазер излучает только свет высокой интенсивности в очень узком интервале длин волн, обычно менее 0,01 нм, что делает ненужным монохроматор или фильтр возбуждения. Недостатком этого метода является то, что длину волны лазера нельзя сильно изменить. Лампа на парах ртути - это линейная лампа, то есть она излучает свет с максимальной длиной волны. Напротив, ксеноновая дуга имеет непрерывный спектр излучения с почти постоянной интенсивностью в диапазоне от 300 до 800 нм и достаточной освещенностью для измерений до чуть более 200 нм.

Во флуориметрах можно использовать фильтры и / или монохроматоры. Монохроматор излучает свет регулируемой длины волны с регулируемым допуском. Самый распространенный тип монохроматора использует дифракционную решетку, то есть коллимированный свет освещает решетку и выходит под другим углом в зависимости от длины волны. Затем монохроматор можно настроить, чтобы выбрать длину волны для передачи. Для измерения анизотропии необходимо добавить два поляризационных фильтра: один после монохроматора или фильтра возбуждения, а другой - перед монохроматором или фильтром излучения.

Как упоминалось ранее, флуоресценцию чаще всего измеряют под углом 90 ° относительно возбуждающего света. Эта геометрия используется вместо размещения датчика на линии возбуждающего света под углом 180 °, чтобы избежать интерференции проходящего возбуждающего света. Нет идеального монохроматора, и он будет передавать некоторые рассеянный свет, то есть свет с длинами волн, отличными от заданной. Идеальный монохроматор будет пропускать свет только в указанном диапазоне и иметь высокую передачу, не зависящую от длины волны. При измерении под углом 90 ° только свет, рассеянный образцом, вызывает рассеянный свет. Это приводит к лучшему соотношению сигнал / шум и снижает предел обнаружения примерно в 10000 раз.[3] по сравнению с геометрией 180 °. Кроме того, флуоресценцию также можно измерить спереди, что часто делается для мутных или непрозрачных образцов.[4]

Детектор может быть одноканальным или многоканальным. Одноканальный детектор может регистрировать интенсивность только одной длины волны за раз, в то время как многоканальный детектор обнаруживает интенсивность всех длин волн одновременно, что делает ненужным эмиссионный монохроматор или фильтр. У разных типов детекторов есть как преимущества, так и недостатки.

Наиболее универсальные флуориметры с двойными монохроматорами и источником света с непрерывным возбуждением могут регистрировать как спектр возбуждения, так и спектр флуоресценции. При измерении спектров флуоресценции длина волны возбуждающего света поддерживается постоянной, предпочтительно на длине волны с высоким поглощением, а эмиссионный монохроматор сканирует спектр. Для измерения спектров возбуждения длина волны, проходящая через эмиссионный фильтр или монохроматор, поддерживается постоянной, а монохроматор возбуждения выполняет сканирование. Спектр возбуждения обычно идентичен спектру поглощения, поскольку интенсивность флуоресценции пропорциональна поглощению.[5]

Анализ данных

GNU R экспорт из OpenChrom
Плагин OpenFluor в OpenChrom показывая соответствие веществ[6]

При низких концентрациях флуоресценция интенсивность обычно будет пропорционален концентрация из флуорофор.

В отличие от УФ / видимой спектроскопии, «стандартные» спектры, не зависящие от прибора, получить нелегко. Несколько факторов влияют на спектры и искажают их, и для получения «истинных», т.е. машинно-независимых, спектров необходимы поправки. Различные типы искажений здесь будут классифицированы как связанные с прибором или сэмплом. Во-первых, обсуждаются искажения, возникающие из-за инструмента. Для начала, интенсивность источника света и характеристики длины волны меняются во времени во время каждого эксперимента и между каждым экспериментом. Кроме того, ни одна лампа не имеет постоянной силы света на всех длинах волн. Чтобы исправить это, после монохроматора возбуждения или фильтра можно применить светоделитель, чтобы направить часть света на опорный детектор.

Кроме того, необходимо учитывать эффективность передачи монохроматоров и фильтров. Они также могут измениться со временем. Эффективность передачи монохроматора также зависит от длины волны. Это причина того, что дополнительный опорный детектор должен быть размещен после монохроматора возбуждения или фильтра. Процент флуоресценции, регистрируемой детектором, также зависит от системы. Кроме того, квантовая эффективность детектора, то есть процент обнаруженных фотонов, варьируется между различными детекторами в зависимости от длины волны и времени, поскольку детектор неизбежно ухудшается.

Две другие темы, которые необходимо учитывать, включают оптику, используемую для направления излучения, и средства удержания или удержания материала образца (называемого кюветой или ячейкой). Для большинства измерений в УФ, видимом и ближнем ИК диапазонах необходимо использование прецизионных кварцевых кювет. В обоих случаях важно выбирать материалы с относительно небольшим поглощением в интересующем диапазоне длин волн. Кварц идеален, потому что пропускает от 200 до 2500 нм; Кварц более высокого качества может пропускать даже до 3500 нм, в то время как поглощающие свойства других материалов могут маскировать флуоресценцию образца.

Коррекция всех этих инструментальных факторов для получения «стандартного» спектра - утомительный процесс, который применяется на практике только тогда, когда это строго необходимо. Это имеет место, например, при измерении квантового выхода или при нахождении длины волны с наибольшей интенсивностью излучения.

Как упоминалось ранее, искажения также возникают из-за образца. Поэтому необходимо учитывать и некоторые аспекты выборки. Во-первых, фоторазложение может со временем снизить интенсивность флуоресценции. Также необходимо учитывать рассеяние света. Наиболее важными типами рассеяния в этом контексте являются рэлеевское и комбинационное рассеяние. Свет, рассеянный Рэлеевское рассеяние имеет ту же длину волны, что и падающий свет, тогда как в Рамановское рассеяние Рассеянный свет обычно изменяет длину волны в сторону более длинных волн. Рамановское рассеяние является результатом виртуального электронного состояния, индуцированного возбуждающим светом. Из этого виртуальное состояние, молекулы могут релаксировать обратно к колебательному уровню, отличному от основного колебательного состояния.[7] В спектрах флуоресценции это всегда видно при постоянной разнице волновых чисел относительно волнового числа возбуждения, например пик появляется на волновом числе 3600 см−1 ниже, чем возбуждающий свет в воде.

Другие аспекты, которые следует учитывать, - это эффекты внутреннего фильтра. К ним относится реабсорбция. Реабсорбция происходит потому, что другая молекула или часть макромолекулы поглощает те длины волн, на которых флуорофор излучает излучение. Если это так, некоторые или все фотоны, испускаемые флуорофором, могут снова поглощаться. Другой эффект внутреннего фильтра возникает из-за высокой концентрации поглощающих молекул, включая флуорофор. В результате интенсивность возбуждающего света непостоянна во всем растворе. В результате только небольшой процент возбуждающего света достигает флуорофоров, видимых для системы обнаружения. Эффекты внутреннего фильтра изменяют спектр и интенсивность излучаемого света, поэтому их необходимо учитывать при анализе спектра излучения флуоресцентного света.[5][8]

Флуоресценция триптофана

В флуоресценция из свернутый белок представляет собой смесь флуоресценции от отдельных ароматических остатков. Большая часть излучения собственной флуоресценции свернутого белка происходит из-за возбуждения триптофан остатки, с некоторыми выбросами из-за тирозина и фенилаланина; но дисульфидные связи также имеют заметное поглощение в этом диапазоне длин волн. Обычно триптофан имеет длину волны максимального поглощения 280 нм и пик излучения, равный сольватохромный, начиная от ок. От 300 до 350 нм в зависимости от полярности окружающей среды [9] Следовательно, флуоресценция белка может использоваться в качестве диагностики конформационного состояния белка.[10] Кроме того, на флуоресценцию триптофана сильно влияет близость других остатков (т.е., рядом протонированный такие группы, как Asp или Glu, могут вызывать закалка флуоресценции Trp). Кроме того, возможна передача энергии между триптофаном и другими флуоресцентными аминокислотами, что может повлиять на анализ, особенно в случаях, когда используется кислотный подход Ферстера. Кроме того, триптофан - относительно редкая аминокислота; многие белки содержат только один или несколько остатков триптофана. Следовательно, флуоресценция триптофана может быть очень чувствительным измерением конформационного состояния отдельных остатков триптофана. Преимущество по сравнению с внешними зондами состоит в том, что сам белок не изменяется. Использование собственной флуоресценции для изучения конформации белка на практике ограничено случаями с несколькими (или, возможно, только одним) остатками триптофана, поскольку каждый из них находится в разных локальных условиях, что приводит к различным спектрам излучения.

Триптофан является важной собственной флуоресцентной (аминокислотой), которая может использоваться для оценки природы микроокружения триптофана. При проведении экспериментов с денатурантами поверхностно-активные вещества или другой амфифильный молекулы, микросреда триптофана может измениться. Например, если белок, содержащий единственный триптофан в своем «гидрофобном» ядре, денатурируется с повышением температуры, появится красный смещенный спектр излучения. Это связано с воздействием на триптофан водной среды, а не гидрофобной внутренней части белка. Напротив, добавление поверхностно-активного вещества к белку, содержащему триптофан, который подвергается воздействию водного растворителя, вызовет смещенный в синий цвет спектр излучения, если триптофан внедрен в поверхностно-активное вещество. везикул или же мицелла.[11] Белки, в которых отсутствует триптофан, могут быть связаны с флуорофор.

При возбуждении флуоресценции на длине волны 295 нм спектр излучения триптофана преобладает над более слабым. тирозин и фенилаланин флуоресценция.

Приложения

Флуоресцентная спектроскопия используется, среди прочего, в биохимических, медицинских и химических исследованиях для анализа органические соединения. Также сообщалось о его использовании для дифференциации злокачественных опухолей кожи от доброкачественных.

Методы атомной флуоресцентной спектроскопии (AFS) полезны в других видах анализа / измерения соединения, присутствующего в воздухе, воде или других средах, таких как CVAFS который используется для обнаружения тяжелых металлов, таких как ртуть.

Флуоресценцию также можно использовать для перенаправления фотонов, см. люминесцентный солнечный коллектор.

Кроме того, флуоресцентную спектроскопию можно адаптировать к микроскопическому уровню, используя микрофлуориметрия

В аналитической химии детекторы флуоресценции используются с ВЭЖХ.

В области исследования воды флуоресцентная спектроскопия может использоваться для мониторинга качества воды путем обнаружения органических загрязнителей.[12] Недавние достижения в области информатики и машинного обучения позволили даже обнаружить бактериальное загрязнение воды. [13]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Анимация по принципу флуоресценции и поглощения в УФ-видимой области
  2. ^ Принципы инструментального анализа Ф. Джеймс Холлер, Дуглас А. Скуг и Стэнли Р. Крауч 2006
  3. ^ Ренделл Д. (1987). Флуоресценция и фосфоресценция. Корона
  4. ^ Эйзингер, Йозеф; Флорес, Хорхе (1979). «Фронтальная флуорометрия жидких образцов». Аналитическая биохимия. 94 (1): 15–21. Дои:10.1016/0003-2697(79)90783-8. ISSN  0003-2697. PMID  464277.
  5. ^ а б Ашутош Шарма; Стивен Г. Шульман (21 мая 1999 г.). Введение в флуоресцентную спектроскопию. Вайли. ISBN  978-0-471-11098-9.
  6. ^ Мерфи, Кэтлин Р.; Стедмон, Колин А .; Вениг, Филипп; Бро, Расмус (2014). «OpenFluor - онлайн-библиотека спектров автофлуоресценции органических соединений в окружающей среде» (PDF). Анальный. Методы. 6 (3): 658–661. Дои:10.1039 / C3AY41935E.
  7. ^ Гауглиц, Г. и Во-Динь, Т. (2003). Справочник по спектроскопии. Вили-ВЧ.
  8. ^ Лакович, Дж. Р. (1999). Принципы флуоресцентной спектроскопии. Kluwer Academic / Plenum Publishers
  9. ^ Собственная флуоресценция белков и пептидов В архиве 2010-05-16 на Wayback Machine
  10. ^ Вивиан Дж. Т., Каллис PR (2001). «Механизмы сдвига флуоресценции триптофана в белках». Биофиз. J. 80 (5): 2093–109. Bibcode:2001BpJ .... 80.2093V. Дои:10.1016 / S0006-3495 (01) 76183-8. ЧВК  1301402. PMID  11325713. Архивировано из оригинал 6 сентября 2008 г.
  11. ^ Капуто, штат Джорджия, Лондон Э. Кумулятивные эффекты аминокислотных замен и гидрофобного несоответствия на трансмембранную стабильность и конформацию гидрофобных альфа-спиралей.Биохимия. 2003 25 марта; 42 (11): 3275-85.
  12. ^ Carstea, Elfrida M .; Бриджмен, Джон; Бейкер, Энди; Рейнольдс, Даррен М. (15 мая 2016 г.). «Флуоресцентная спектроскопия для мониторинга сточных вод: обзор». Водные исследования. 95: 205–219. Дои:10.1016 / j.watres.2016.03.021. ISSN  0043-1354. PMID  26999254.
  13. ^ Накар, Амир; Шмилович, Зеев; Вайзел-Охайон, Далит; Крупицки Юлия; Борисовер, Михаил; Села (Салдингер), Шломо (01.02.2020). «Количественное определение бактерий в воде с использованием PLS анализа спектров излучения флуоресценции и матрицы возбуждения-излучения». Водные исследования. 169: 115197. Дои:10.1016 / j.watres.2019.115197. ISSN  0043-1354. PMID  31670087.

внешняя ссылка