Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия - Fluorescence cross-correlation spectroscopy

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) был представлен Эйген и Риглер в 1994 г.^[1] и экспериментально реализовано Schwille в 1997 г.^[2] По сути, это расширение флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) с использованием двух разноокрашенных молекул вместо одной. Другими словами, совпадающие флуктуации интенсивности зеленого и красного разных молекул коррелируют, если частицы, помеченные зеленым и красным, движутся вместе через заранее определенный конфокальный объем. В результате FCCS обеспечивает высокочувствительное измерение молекулярных взаимодействий независимо от скорости диффузии. Это важное достижение, учитывая, что скорость диффузии слабо зависит от размера молекулярного комплекса.^[3]

Карикатура с фокусным объемом FCCS

FCCS использует два вида, которые независимо помечены двумя флуоресцентными зондами разного цвета. Эти флуоресцентные зонды возбуждаются и обнаруживаются двумя разными источниками лазерного света и детекторами, обычно обозначенными как «зеленый» и «красный». Обычно конфокальный микроскоп используется для обеспечения перекрытия зеленого и красного фокусных объемов для возбуждения.

Моделирование FCCS, демонстрирующее невзаимодействующие частицы (слева) и смесь взаимодействующих и независимых частиц (справа)

Нормализованная функция взаимной корреляции определена для двух флуоресцентных видов. ${\displaystyle \ G}$ и ${\displaystyle \ R}$ которые являются независимыми зелеными, G и красными, R каналами, а именно:

${\displaystyle \ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {\langle \delta I_{G}(t)\delta I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}={\frac {\langle I_{G}(t)I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}}$

где дифференциальные флуоресцентные сигналы ${\displaystyle \ \delta I_{G}}$ в определенное время, ${\displaystyle \ t}$ и ${\displaystyle \ \delta I_{R}}$ во время задержки, ${\displaystyle \ \tau }$ позже соотносятся друг с другом. В отсутствие спектрального просвечивания функция взаимной корреляции равна нулю для невзаимодействующих частиц. В отличие от FCS, функция взаимной корреляции увеличивается с увеличением числа взаимодействующих частиц.

FCCS в первую очередь используется для измерения биомолекулярных взаимодействий как в живых клетках, так и in vitro.^[4][5] Его можно использовать для измерения простых молекулярных стехиометрий и констант связывания.^[6] Это один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте в пределах живой клетки. В отличие от флуоресцентный резонансный перенос энергии, у него нет ограничения по расстоянию для взаимодействий. В результате его можно использовать для исследования больших комплексов. Тем не менее, для этого требуется, чтобы комплексы активно диффундировали через фокус микроскопа в относительно короткий промежуток времени (обычно секунды).

Моделирование

Кривые взаимной корреляции моделируются в соответствии с несколько более сложной математической функцией, чем применяемая в FCS. Прежде всего, эффективный наложенный объем наблюдения, в котором каналы G и R образуют единый объем наблюдения, ${\displaystyle \ V_{eff,RG}}$ в растворе:

${\displaystyle \ V_{eff,RG}=\pi ^{3/2}(\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2})(\omega _{z,G}^{2}+\omega _{z,R}^{2})^{1/2}/2^{3/2}}$

куда ${\displaystyle \ \omega _{xy,G}^{2}}$ и${\displaystyle \ \omega _{xy,R}^{2}}$ - радиальные параметры и ${\displaystyle \ \omega _{z,G}}$ и${\displaystyle \ \omega _{z,R}}$ - аксиальные параметры для каналов G и R.

Время диффузии, ${\displaystyle \ \tau _{D,GR}}$ для дважды (G и R) флуоресцентных частиц описывается следующим образом:

${\displaystyle \ \tau _{D,GR}={\frac {\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2}}{8D_{GR}}}}$

куда ${\displaystyle \ D_{GR}}$ - коэффициент диффузии дважды флуоресцентной частицы.

Кривая взаимной корреляции, полученная при диффузии дважды меченых флуоресцентных частиц, может быть смоделирована в отдельных каналах следующим образом:

${\displaystyle \ G_{G}(\tau )=1+{\frac {(<C_{G}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{G}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

${\displaystyle \ G_{R}(\tau )=1+{\frac {(<C_{R}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{R}>+<C_{GR}>)^{2}}}}$

В идеальном случае функция взаимной корреляции пропорциональна концентрации дважды меченого флуоресцентного комплекса:

${\displaystyle \ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {<C_{GR}>Diff_{GR}(\tau )}{V_{eff}(<C_{G}>+<C_{GR}>)(<C_{R}>+<C_{GR}>)}}}$

с ${\displaystyle \ Diff_{k}(\tau )={\frac {1}{(1+{\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})(1+a^{-2}({\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})^{1/2}}}}$

Амплитуда взаимной корреляции прямо пропорциональна концентрации двухкомпонентных (красных и зеленых) видов. ^[7]

Смотрите также

• Динамическое рассеяние света
• Флуоресцентная спектроскопия
• Коэффициент диффузии

Рекомендации

1. Эйген, М. и Риглер, Р. Сортировка отдельных молекул: применение в диагностике и эволюционной биотехнологии. (1994) Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 91, 5740-5747.
2. Schwille, P .; Myer-Almes, F.J .; Риглер, Р. Двухцветная кросс-корреляционная флуоресцентная спектроскопия для многокомпонентного диффузионного анализа в растворе. (1997) Биофиз. Дж. 72, 1878-1886.
3. Ито, К .; Isobe, K .; Ватанабе В. Функциональная визуализация с помощью управляемых нелинейных оптических явлений. (2013) Джон Уайли и сыновья
4. Bacia, K .; Kim, S.A .; Швилл, П. Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия в живых клетках. (2006) Nat. Meth. 3, 83-89 .
5. Слотер, Б.Д .; Unruh, J. R .; Ли, Р. Спектроскопия флуоресцентных флуктуаций и методы визуализации для изучения динамических взаимодействий белков в дрожжах. В методах молекулярной биологии: системная биология дрожжей. J.I. Castrillo, S.G.Oliver, Eds. (Спрингер, Нью-Йорк, 2011). Vol. 759, г. С. 283-306.
6. Чен, Ю. и Мюллер, Дж. Д. Определение стехиометрии белковых гетерокомплексов в живых клетках с помощью флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. (2006) Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 104, 3147-3152.
7. http://www.rci.rutgers.edu/~moghe/biophy%20j%2083_1184.pdf

внешняя ссылка

• Кросс-корреляция флуоресценции (FCCS) (Becker & Hickl GmbH, веб-страница)