Количество виртуальных колоний - Virtual colony count

Количество виртуальных колоний (VCC) кинетическая, 96-луночная микробиологический проба изначально разработан для измерения активности дефенсины.[1] С тех пор он был применен к другим антимикробные пептиды включая LL-37.[2] В нем используется метод подсчета бактерий, называемый количественной кинетикой роста, который сравнивает время, необходимое для достижения пороговой оптической плотности пакетной бактериальной культурой, с временем для серии калибровочных кривых. Название VCC также использовалось для описания применения количественной кинетики роста для подсчета бактерий в моделях инфицирования культур клеток.[3]Тест на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) можно проводить на 96-луночных планшетах путем разбавления противомикробный агент в различных концентрациях в бульоне, засеянном бактерии и измерения минимальная ингибирующая концентрация это не приводит к росту. Однако эти методы нельзя использовать для изучения некоторых мембранно-активных антимикробные пептиды, которые подавляются самим бульоном. Процедура виртуального подсчета колоний использует этот факт, сначала подвергая бактериальные клетки действию активного противомикробного агента в малосолевой среде. буфер в течение двух часов, затем одновременно подавляя антимикробную активность и индуцируя экспоненциальный рост добавив бульона. В кинетика роста выживших клеток можно контролировать с помощью терморегулятора. считыватель планшетов.

Количественная кинетика роста

Калибровочные кривые VCC

Методика перебора[4] выживших клеток, используемых VCC, называется количественной кинетикой роста (QGK). Он связывает кинетическое время, необходимое для мутность бактериальной партии микробиологическая культура в лунке 96-луночного микропланшет для достижения пороговой разницы по мутности до 10-кратного разбавления серии калибровочных кривых роста.

Количественная оценка количества жизнеспособных клеток выполняется с использованием процесса, математически идентичного количественному. полимеразная цепная реакция в реальном времени (QPCR), кроме QGK клетки, а не копии продуктов ПЦР, растут экспоненциально. Время, необходимое для достижения порога, называется «пороговым временем», Tт, что эквивалентно QPCR значение «время цикла» или Cт.

Существует как минимум пять процессов, которые вызывают задержки порогового времени в анализах VCC:

1. Адгезия, заставляющая клетки прилипать к микропланшету и, возможно, образовывать биопленки. Если эти клетки не окажутся непосредственно на пути света, их рост не повлияет на показания оптической плотности.

2. Сплоченность, заставляющая клетки объединяться в группы различного размера вместо гомогенной суспензии отдельных клеток, подвергающихся двойное деление. Сплоченность может вызвать неточность и колебания Tт. Связные комки также могут быть адгезивными, что приводит как к неточности из-за когезии, так и к неточности (увеличение Tт) за счет адгезии.

3. Бактериостатический активность, в результате чего клетки становятся неспособными к экспоненциальному росту, даже если они не погибают. Преходящая бактериостатическая активность может вызывать задержки, увеличивая Tт.

4. Фаза метаболического лага рост бактерий. Ожидается, что такая лаг-фаза будет иметь место в анализе, поскольку клетки, растущие медленно или не растущие вообще во время первоначального воздействия антимикробных пептидов в буфере с низким содержанием соли, смещаются в сторону экспоненциального роста при добавлении дважды концентрированной богатой среды. Если эта метаболическая задержка фазы увеличивается в присутствии антимикробного пептида, это можно рассматривать как форму временной бактериостатической активности в категории 3, выше, хотя другие источники временной бактериостатической активности, такие как задержка из-за времени, необходимого для восстановления поврежденных клеточных структур, таких как клеточные стенки или же клеточные мембраны, возможно.

5. Бактерицидный деятельность или убийство. Меньшее количество выживших клеток вызывает задержку Tт поскольку выжившим требуется больше времени, чтобы произвести такое же количество мутности за счет экспоненциального роста. Если все остальные процессы, вызывающие увеличение Tт пренебрежимо малы, анализ VCC становится бактерицидным, а Tт может использоваться для подсчета жизнеспособных бактерий с помощью QGK. В этом упрощенном случае результаты «виртуальной выживаемости» VCC эквивалентны результатам «выживаемости» традиционного бактерицидного анализа подсчета колоний.

Бактерии

Первоначально VCC использовался для количественной оценки антибактериальной активности пептидов против шести штаммов кишечная палочка, Золотистый стафилококк, Bacillus cereus, и Enterobacter aerogenes.[1] Обычно стандарт Грамотрицательный и Грамположительный контроль качества деформации сравниваются. кишечная палочка ATCC 25922 и Золотистый стафилококк ATCC 29213 использовался как стандартные грамотрицательные и грамположительные штаммы соответственно. VCC также применяется к бацилла сибирской язвы, возбудитель сибирская язва.[5]

Антимикробные пептиды

Первоначальное исследование виртуального подсчета колоний измеряло активность всех шести человек. альфа-дефенсины одновременно на одном 96-луночном планшете: HNP1, HNP2, HNP3, HNP4, HD5, и HD6.[1] Впоследствии мутировавший формы некоторых из этих шести дефенсинов были изучены VCC. Консервированный глицин в бета-выпуклость в HNP2 была заменена на серию D-аминокислоты в результате активность VCC пропорциональна боковой цепи гидрофобность и зарядить.[6] VCC показал, что активность HNP2, ацетилированного на N-конце и / или амидированного на C-конце, пропорциональна электростатический обвинять.[7] Результаты VCC снова были пропорциональны заряду для серии мутантов, разрушающих солевой мостик, предполагая, что солевой мостик не требуется для функции HNP2.[8] VCC измерила важность N-концевых естественных и искусственных сегментов пропептид HNP1, резко изменяющий активность против кишечная палочка и Золотистый стафилококк.[9][10] Энантиомер формы HNP1, HNP4, HD5 и бета-дефенсин HBD2 полностью состоящий из D-аминокислот, предполагает различные механизмы активности дефенсина против Грамположительный и Грамотрицательный бактерии.[11] Результаты VCC для мономерных и связанных димерных форм HNP1 с нарушенной димеризацией продемонстрировали важность димеризация.[12] Замена консервативного глицина на L-аланин привело к незначительным отличиям VCC.[13] Всесторонний аланиновое сканирование мутагенез HNP1[14][15] и HD5[16] продемонстрировали важность объемных гидрофобных остатков. Эти исследования недавно были расширены за счет включения дополнительных бета-дефенсины, тета-дефенсины,[5] и человеческий кателицидин LL-37 и родственные пептиды.[2]

Безопасная и эффективная техника дозирования

Пользователям VCC рекомендуется переносить клетки в небольшом объеме, таком как 10 микролитров, под больший объем, например 90 микролитров, аналогично калибровочным кривым QGK, показанным выше, и калибровочным кривым, указанным в первоначальной публикации VCC,[1] но в отличие от экспериментальной процедуры, использованной для проверки активности дефенсина в той же статье. Улучшенный пипетирование методика была описана в 2011 г. в исследовании биобезопасность уровень 3 (BSL-3) возбудитель бацилла сибирской язвы.[5] Оригинальный метод, опубликованный в 2005 году, включал перенос 50 микролитров клеточных суспензий в 50 микролитров жидкости, что приводит к образованию пены, пузырьков и помутнения, несовместимых с турбидиметрическим методом, когда клетки переносятся непосредственно на дно лунок под фосфатным буфером. решения. Чтобы избежать этой проблемы, добавьте клеточные суспензии, поскольку капли сверху могут вызвать аэрозоли что приводит к перекрестному заражению.[17] Биоаэрозоли опасных бактерий также могут создавать риски для безопасности, которые можно уменьшить, проводя эксперименты в шкаф биобезопасности.

Рекомендации

  1. ^ а б c d Эриксен Б., Ву З., Лу В., Лерер Р.И. (2005). «Антибактериальная активность и специфичность шести α-дефенсинов человека». Антимикробный. Агенты Chemother. 49 (1): 269–75. Дои:10.1128 / AAC.49.1.269-275.2005. ЧВК  538877. PMID  15616305.
  2. ^ а б Пазгиер М., Эриксен Б., Линг М., Тот Э.А., Ши Дж., Ли Х, Галлихер-Бекли А., Лан Л., Цзоу Г., Чжан С., Юань В., Пожарски Е., Лу В. (2013). «Структурный и функциональный анализ продомена кателицидина человека LL-37». Биохимия. 52 (9): 1547–58. Дои:10.1021 / bi301008r. ЧВК  3634326. PMID  23406372.
  3. ^ Хоффманн С., Вальтер С., Блюм А. К., Фукс С., Шмидт С., Шольц А., Герлах Р. Г. (2018). «Высокопроизводительная количественная оценка взаимодействия бактерий и клеток с использованием виртуального подсчета колоний». Передняя микробиология клеточного заражения. 8 (43). Дои:10.3389 / fcimb.2018.00043. ЧВК  5818393. PMID  29497603.
  4. ^ Брюстер, JD. (2003). «Простой тест на микрорастение для подсчета бактерий». J Microbiol методы. 53 (1): 77–86. Дои:10.1016 / S0167-7012 (02) 00226-9. PMID  12609726.
  5. ^ а б c Велкос С., Кот СК, Хан У, Шастак О, Джедерманн Дж, Бозуэ Дж, Юнг Дж, Ручала П., Пратихья П., Тан Т., Лерер Р., Бейер В. (2011). «Гуманизированные тета-дефенсины (ретроциклины) улучшают работу макрофагов и защищают мышей от экспериментальных инфекций сибирской язвы». Антимикробный. Агенты Chemother. 55 (9): 4238–50. Дои:10.1128 / AAC.00267-11. ЧВК  3165295. PMID  21768520.
  6. ^ Се С., Прахл А., Эриксен Б., Ву З., Цзэн П., Ли Х, Лу В.Й., Любковски Дж., Лу В. (2005). «Реконструкция консервативного бета-балджа в дефенсинах млекопитающих с использованием D-аминокислот». J Biol Chem. 280 (38): 32921–9. Дои:10.1074 / jbc.M503084200. PMID  15894545.
  7. ^ Се С., Цзэн П., Эриксен Б., Ву З., Лу В.Й., Лу В. (2005). «Влияние концевых зарядов в человеческом нейтрофильном альфа-дефенсине 2 на его бактерицидную и мембранную активность». Пептиды. 26 (12): 2377–83. Дои:10.1016 / j.peptides.2005.06.002. PMID  16009464.
  8. ^ Ву З, Ли Х, де Лиу Э, Эриксен Б., Лу В. (2005). «Почему солевой мостик Arg5-Glu13 сохраняется в альфа-дефензинах млекопитающих?». J Biol Chem. 280 (52): 43039–47. Дои:10.1074 / jbc.M510562200. PMID  16246847.
  9. ^ Ву З, Ли Х, Эриксен Б., де Лиу Э, Цзоу Г., Цзэн П, Се Ц, Ли С, Любковски Дж, Лу В.Й., Лу В. (2007). «Влияние про-сегментов на сворачивание и функцию альфа-дефенсинов нейтрофилов человека». Дж Мол Биол. 368 (2): 537–49. Дои:10.1016 / j.jmb.2007.02.040. ЧВК  2754399. PMID  17355880.
  10. ^ Zou G, de Leeuw E, Lubkowski J, Lu W (2008). «Молекулярные детерминанты взаимодействия нейтрофилов альфа дефенсина 1 человека с его пропептидом». Дж Мол Биол. 381 (5): 1281–91. Дои:10.1016 / j.jmb.2008.06.066. ЧВК  2754386. PMID  18616948.
  11. ^ Вэй Джи, де Леу Э, Пазгиер М., Юань В., Цзоу Дж., Ван Дж., Эриксен Б., Лу В.Й., Лерер Р.И., Лу В. (2009). «Через зеркало - механистические открытия энантиомерных дефензинов человека». J Biol Chem. 284 (42): 29180–92. Дои:10.1074 / jbc.M109.018085. ЧВК  2781462. PMID  19640840.
  12. ^ Пазгиер М., Вей Дж., Эриксен Б., Юнг Дж., Ву З., де Лиу Е., Юань В., Шмацински Х., Лу В. Ю., Лубковски Дж., Лерер Р. И., Лу В. (2012). «Иногда для танго нужны двое: вклад димеризации в функции пептида α-дефенсина HNP1 человека». J Biol Chem. 287 (12): 8944–53. Дои:10.1074 / jbc.M111.332205. ЧВК  3308808. PMID  22270360.
  13. ^ Чжао Л., Эриксен Б., Ву Х, Чжань С., Юань В., Ли Х, Пазгьер М., Лу В. (2012). «Инвариантный гликолевый остаток важен для укладки, димеризации и функции α-дефенсина: тематическое исследование α-дефенсина HNP1 нейтрофилов человека». J Biol Chem. 287 (23): 18900–12. Дои:10.1074 / jbc.M112.355255. ЧВК  3365925. PMID  22496447.
  14. ^ Вэй Дж., Пазгиер М., де Лиу Э., Раджаби М., Ли Дж., Цзоу Дж., Юнг Дж., Юань В., Лу В. Ю., Лерер Р. И., Лу В. (2010). «Trp-26 придает функциональную универсальность человеческому альфа-дефенсину HNP1». J Biol Chem. 285 (21): 16275–85. Дои:10.1074 / jbc.M110.102749. ЧВК  2871495. PMID  20220136.
  15. ^ Чжао Л., Толберт В.Д., Эриксен Б., Чжан С., Ву Х, Юань В., Ли Х, Пазгьер М., Лу В. (2013). «Одинарные, двойные и четверные замены аланина на олигомерных интерфейсах определяют гидрофобность как ключевой фактор, определяющий функцию альфа-дефенсина HNP1 нейтрофилов человека». PLOS ONE. 8 (11): e78937. Дои:10.1371 / journal.pone.0078937. ЧВК  3827289. PMID  24236072.
  16. ^ Раджаби М., Эриксен Б., Ву Х, де Леу Э., Чжао Л., Пазгьер М., Лу В. (2012). «Функциональные детерминанты кишечного α-дефенсина HD5 человека: решающая роль для гидрофобности на границе раздела димеров». J Biol Chem. 287 (26): 21615–27. Дои:10.1074 / jbc.M112.367995. ЧВК  3381126. PMID  22573326.
  17. ^ Эриксен Б. (2014). «Безопасность, эффективность и полезность методов переноса адгезивных и когезионных клеток Escherichia coli на микропланшеты во избежание образования аэрозолей». F1000Res. 3: 267. Дои:10.12688 / f1000research.5659.2. ЧВК  4309163. PMID  25671086.

внешняя ссылка