TUNEL анализ - TUNEL assay

Печень мыши с апоптотической клеткой, окрашенной TUNEL

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP маркировка концов ников (ТУНЕЛЬ) - метод обнаружения Фрагментация ДНК путем маркировки 3'-гидроксильных концов в двухцепочечные разрывы ДНК генерируется во время апоптоз.[1][2]

Метод

TUNEL - это метод обнаружения апоптотический ДНК фрагментация, широко используемая для идентификации и количественной оценки апоптозных клеток или для обнаружения чрезмерного разрыва ДНК в отдельных клетках.[3] В проба полагается на использование терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT), и фермент который катализирует прикрепление дезоксинуклеотидов, помеченных флуорохром или другой маркер, к 3'-гидроксильным концам двухцепочечных разрывов ДНК. Он также может маркировать клетки, ДНК которых повреждена не в ходе апоптоза.

История

Анализ TUNEL на основе флуорохромов, применимый для проточной цитометрии, совмещая обнаружение разрывов цепей ДНК относительно клеточный цикл -фазовое положение, было первоначально разработано Gorczyca et al.[4] Одновременно, анализ мечения авидин-пероксидазой, применимый для поглощение света микроскоп был описан Gavrieli et al.[5] С 1992 года TUNEL стал одним из основных методов обнаружения апоптотической запрограммированной гибели клеток.[6] Однако в течение многих лет велись споры о его точности из-за проблем в исходном анализе, которые вызывали некротический клетки, которые были неправильно обозначены как апоптотические.[7] Впоследствии этот метод был значительно улучшен, и при правильном выполнении он должен идентифицировать клетки только на последней стадии апоптоз.[8][9] Новые методы включают dUTP, модифицированные флуорофорами или гаптенами, включая биотин или же бром, который может быть обнаружен непосредственно в случае флуоресцентно-модифицированного нуклеотид (т.е. флуоресцеин-dUTP), или косвенно со стрептавидином или антитела, если используются биотин-dUTP или BrdUTP соответственно. Наиболее чувствительным из них является метод включения BrdUTP путем TdT с последующим иммуноцитохимическим обнаружением Брду.[10]

Рекомендации

  1. ^ Горчица В., Траганос Ф., Есионовска Х., Дарзинкевич З. (1993). «Наличие разрывов цепи ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных сперматозоидах человека. Аналогия апоптозу соматических клеток». Exp Cell Res. 207 (1): 202–205. Дои:10.1006 / excr.1993.1182. PMID  8391465.
  2. ^ Лосано Дж. М., Бехарано И., Эспино Дж., Гонсалес Д., Ортис А., Гарсия Дж. Ф., Родригес А. Б., Париенте Дж. А. (2009). «Капситация с градиентом плотности - наиболее подходящий метод для улучшения оплодотворения и снижения фрагментации ДНК сперматозоидов бесплодных мужчин». Анатолийский журнал акушерства и гинекологии. 3 (1): 1–7.
  3. ^ Лосано Дж. М., Бехарано И., Эспино Дж., Гонсалес Д., Ортис А., Гарсия Дж. Ф., Родригес А. Б., Париенте Дж. А. (2009). «Взаимосвязь между активностью каспазы и маркерами апоптоза в сперме человека в ответ на перекись водорода и прогестерон». Журнал воспроизводства и развития. 55 (6): 615–621. Дои:10.1262 / jrd.20250. PMID  19734695.
  4. ^ Gorczyca W, Bruno S, Darzynkiewicz RJ, Gong J, Darzynkiewicz Z (1992). «Разрывы цепи ДНК, происходящие во время апоптоза: их раннее обнаружение in situ с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и анализов ник-трансляции и предотвращение с помощью ингибиторов сериновой протеазы». Международный журнал онкологии. 1 (6): 639–648. Дои:10.3892 / ijo.1.6.639. PMID  21584593.
  5. ^ Гавриэли Y, Шерман Y, Бен-Сассон С.А. (1992). «Идентификация запрограммированной гибели клеток in situ с помощью специфической маркировки фрагментации ядерной ДНК». J. Cell Biol. 119 (3): 493–501. Дои:10.1083 / jcb.119.3.493. ЧВК  2289665. PMID  1400587.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  6. ^ Darzynkiewicz Z, Galkowski D, Zhao H (2008). «Анализ апоптоза цитометрией с использованием анализа TUNEL». Методы. 44 (3): 250–254. Дои:10.1016 / j.ymeth.2007.11.008. ЧВК  2295206. PMID  18314056.
  7. ^ Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, ​​Bukowska K, Bursch W., Schulte-Hermann R (1995). «Обнаружение фрагментированной ДНК in situ (анализ TUNEL) не позволяет различать апоптоз, некроз и аутолитическую гибель клеток: предостережение». Гепатология. 21 (5): 1465–8. Дои:10.1002 / hep.1840210534. PMID  7737654.
  8. ^ Negoescu A, Lorimier P, Labat-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C, Brambilla E (1996). «Мечение апоптотических клеток in situ методом TUNEL: улучшение и оценка клеточных препаратов». J Histochem Cytochem. 44 (9): 959–68. Дои:10.1177/44.9.8773561. PMID  8773561.
  9. ^ Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F (1998). «Важность фрагментации ДНК в апоптозе с учетом специфичности TUNEL». Biomed Pharmacother. 52 (6): 252–8. Дои:10.1016 / S0753-3322 (98) 80010-3. PMID  9755824.
  10. ^ Ли X, Darzynkiewicz Z (1995). «Маркировка разрывов цепи ДНК с помощью BrdUTP. Обнаружение апоптоза и пролиферации клеток». Распространение клеток. 28 (11): 571–579. Дои:10.1111 / j.1365-2184.1995.tb00045.x. PMID  8555370.

внешняя ссылка