Фрагментация ДНК - DNA fragmentation

Фрагментация ДНК это разделение или разрыв ДНК пряди на кусочки. Это может быть сделано специально лабораторным персоналом или клетками, или может произойти спонтанно. Спонтанная или случайная фрагментация ДНК - это фрагментация, которая постепенно накапливается в клетке. Его можно измерить, например, в Кометный анализ или TUNEL анализ.

Мужчины с подвижность сперматозоидов дефекты часто имеют высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов.[1]Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах может предсказать результаты экстракорпоральное оплодотворение[2] (ЭКО) и его расширение интрацитоплазматическая инъекция спермы[3] (ИКСИ). В дисперсия хроматина спермы тест (SCD) и TUNEL анализ оба эффективны при обнаружении повреждений ДНК сперматозоидов.[4][5] С помощью светлопольная микроскопия, тест SCD оказывается более чувствительным, чем тест TUNEL.[5]

Его основная меры измерения это индекс фрагментации ДНК (DFI).[3] DFI 20% или более значительно снижает вероятность успеха после ИКСИ.[3]

Фрагментация ДНК была впервые задокументирована Уильямсоном в 1970 году, когда он обнаружил дискретные олигомерные фрагменты, возникающие во время гибели клеток в первичных культурах неонатальной печени. Он описал цитоплазматическую ДНК, выделенную из клеток печени мыши после культивирования, которая характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярный вес состоящий из числа, кратного 135 кДа. Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК были специфическим продуктом деградации ядерной ДНК.[6]

Преднамеренный

Фрагментация ДНК часто необходима до создания библиотеки или субклонирование для последовательностей ДНК. В тех случаях, когда ДНК фрагментируется лабораторным персоналом, использовались различные методы, включающие механический разрыв ДНК. Такие методы включают обработку ультразвуком, игольчатый сдвиг, распыление, сдвиг с острием и прохождение через камеру давления.[7]

  • Дайджест ограничений преднамеренное лабораторное разрушение цепей ДНК. Это обработка на основе ферментов, используемая в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие нити с целью изучения различий в длине фрагментов между людьми или для клонирования генов.[8] Этот метод фрагментирует ДНК либо путем одновременного расщепления обеих цепей, либо путем создания разрывов на каждой цепи дцДНК с образованием разрывов дцДНК.[9]
  • Акустический сдвиг передачи высокочастотных акустических энергетических волн, доставляемых в библиотеку ДНК. Преобразователь имеет форму чаши, так что волны сходятся в интересующей цели.[9]
  • Распыление заставляет ДНК проходить через небольшое отверстие в распылитель агрегат, что приводит к образованию собираемого мелкого тумана. Размер фрагмента определяется давлением газа, используемого для проталкивания ДНК через распылитель, скоростью, с которой раствор ДНК проходит через отверстие, вязкостью раствора и температурой.[9][10]
  • Обработка ультразвуком, тип гидродинамического сдвига, подвергает ДНК акустической кавитации и гидродинамическому сдвигу при кратковременном воздействии ультразвуком, что обычно приводит к фрагментам размером 700 п.н. Для фрагментации ДНК обработка ультразвуком обычно применяется во время импульсных циклов с использованием ультразвукового устройства зондового типа.[11]
  • Для создания гидродинамических сил сдвига, типа гидродинамического сдвига, используется шприцевой насос, проталкивая библиотеку ДНК через небольшое резкое сокращение. Около 90% длин фрагментов попадают в двукратный диапазон.[9]
  • Срезание иглой создает силы сдвига, пропуская библиотеки ДНК через иглу малого диаметра.[9] ДНК проходит через калибровочную иглу несколько раз, чтобы физически разорвать ДНК на мелкие кусочки.
  • Французские ячейки давления пропустите ДНК через узкий клапан под высоким давлением, чтобы создать высокие усилия сдвига.[9] С помощью французского пресса усилие сдвига можно точно регулировать, регулируя давление поршня. Пресс обеспечивает однократный проход через точку максимальной силы сдвига, ограничивая повреждение хрупких биологических структур из-за повторяющегося сдвига, как при других методах разрушения.
  • При опосредованной транспозомой фрагментации (мечения) транспосомы получают с ДНК, которая затем разрезается, так что события транспозиции приводят к фрагментированной ДНК с адаптерами (вместо вставки). Относительная концентрация транспосом и ДНК должна быть соответствующей.

Спонтанный

Апоптотическая фрагментация ДНК это естественная фрагментация, в которой клетки выполняют апоптоз (запрограммированная гибель клеток). Фрагментация ДНК - биохимический признак апоптоз. В умирающих клетках ДНК расщепляется эндонуклеазой, которая фрагментирует хроматин на нуклеосомные единицы, кратные примерно 180 п.н. олигомеры и выглядят как лестница ДНК при работе с агарозным гелем.[12] В фермент за апоптотическую фрагментацию ДНК отвечает ДНКаза, активируемая каспазой. CAD обычно подавляется другим белком, Ингибитор ДНКазы, активируемой каспазой (ICAD). Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза 3, расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD.[13]

Двойная цепь ДНК, обернутая вокруг ядра гистоновых белков.
А нуклеосома, состоящий из ДНК (серый), обернутой вокруг гистон тетрамер (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в межнуклеосомный линкер область, входящая в состав ДНК нет обернутые вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК в межнуклеосомных линкерных сайтах между нуклеосомами, белковосодержащими структурами, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 п.н. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов, основных белков нуклеосом. Сайты линкера - единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны CAD.

Использует

Фрагментация ДНК играет важную роль в судебной медицине, особенно ДНК-профилирование.

  • Полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) - это метод анализа фрагментов ДНК переменной длины, возникающих в результате переваривания образца ДНК с помощью эндонуклеаза рестрикции. Эндонуклеаза рестрикции разрезает ДНК по определенной последовательности, известной как сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Присутствие или отсутствие определенных сайтов узнавания в образце ДНК генерирует фрагменты ДНК различной длины, которые разделяются с использованием гель-электрофорез. Затем их гибридизуют с ДНК-зондами, которые связываются с комплементарной последовательностью ДНК в образце.[14]
  • В анализе полимеразной цепной реакции (ПЦР) создаются миллионы точных копий ДНК из биологического образца. Он использовался для амплификации определенной области цепи ДНК (мишени ДНК). Большинство методов ПЦР обычно амплифицируют фрагменты ДНК от 0,1 до 10 кг. пар оснований (kb), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 kb.[14] ПЦР также использует тепло для разделения цепей ДНК.
  • ДНК, фрагментированная во время апоптоза, размером от 1 до 20 нуклеосом, может быть выборочно выделена из клеток, зафиксированных в денатурирующем фиксирующем этаноле. [15]

Рекомендации

  1. ^ Беллок С., Бенкхалифа М., Коэн-Бакри М., Даллек А., Чахин Н., Амар Е., Зини А. (2014). «Какая изолированная аномалия сперматозоидов больше всего связана с повреждением ДНК сперматозоидов у мужчин, обращающихся для оценки бесплодия». J. Assist. Репродукция. Genet. 31 (5): 527–32. Дои:10.1007 / s10815-014-0194-3. ЧВК  4016368. PMID  24566945.
  2. ^ Саймон Л., Брунборг Г., Стивенсон М., Латтон Д., Макманус Дж., Льюис С.Е. (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в исходе вспомогательной репродукции». Hum Reprod. 25 (7): 1594–1608. Дои:10.1093 / humrep / deq103. PMID  20447937.
  3. ^ а б c Speyer BE, Pizzey AR, Ranieri M, Joshi R, Delhanty JD, Serhal P (май 2010 г.). «Снижение числа имплантаций после ИКСИ со спермой с высокой фрагментацией ДНК». Hum Reprod. 25 (7): 1609–1618. Дои:10.1093 / humrep / deq116. PMID  20495207.
  4. ^ Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, ​​Darzynkiewicz Z (1993). «Наличие разрывов цепи ДНК и повышенная чувствительность ДНК in situ к денатурации в аномальных сперматозоидах человека. Аналогия апоптозу соматических клеток». Exp Cell Res. 207 (1): 202–205. Дои:10.1006 / excr.1993.1182. PMID  8391465.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  5. ^ а б Чжан Л.Х., Цю И, Ван К.Х., Ван Ц., Тао Дж, Ван Л.Г. (июнь 2009 г.). «Измерение фрагментации ДНК сперматозоидов с использованием светлопольной микроскопии: сравнение между тестом на дисперсию хроматина сперматозоидов и анализом мечения на конце уридина». Fertil. Стерил. 94 (3): 1027–1032. Дои:10.1016 / j.fertnstert.2009.04.034. PMID  19505686.
  6. ^ Уильямсон, Роберт (1970). «Свойства быстро меченных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенных из цитоплазмы первичных культур эмбриональных клеток печени мыши». Журнал молекулярной биологии. 51 (1): 157–168. Дои:10.1016/0022-2836(70)90277-9. PMID  5481278.
  7. ^ Перепел, Майкл Эндрю (2010). ДНК: механический разрыв. Онлайн-библиотека. Дои:10.1002 / 9780470015902.a0005333.pub2. ISBN  978-0470016176.
  8. ^ Филлипс, Теареза. «Объяснение рестрикционных ферментов». Биотехнологии / Биомедицина. About.com. Получено 2 апреля 2013.
  9. ^ а б c d е ж «Фрагментация ДНК». Биолаборатории Новой Англии. Получено 2 апреля 2013.
  10. ^ Самбрук, Джозеф; Рассел, Дэвид В. «Фрагментация ДНК путем распыления». Статья. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор. Получено 3 апреля 2013.
  11. ^ «Ультразвуковой лизис: разрушение клеток и фрагментация экстракции». Получено 15 мая 2017.
  12. ^ Nagata S (апрель 2000 г.). «Апоптотическая фрагментация ДНК». Exp. Cell Res. 256 (1): 12–8. Дои:10.1006 / excr.2000.4834. PMID  10739646.
  13. ^ Энари, Масато; Сакахира, Хидеки; Ёкояма, Хидеки; Окава, Кацуя; Ивамацу, Акихиро; Нагата Сигекадзу (январь 1998 г.). «Активированная каспазой ДНКаза, которая разрушает ДНК во время апоптоза, и ее ингибитор ICAD». Статья. Издательская группа "Природа". 391 (6662): 43–50. Дои:10.1038/34112. PMID  9422506. Получено 8 апреля 2013.
  14. ^ а б «ДНК-криминалистика». Геномные программы Министерства энергетики США. Получено 8 апреля 2013.
  15. ^ Гонг Дж. П., Траганос Ф, Дарзынкевич З. (1994). «Селективная процедура выделения ДНК из апоптотических клеток, применимая для гель-электрофореза и проточной цитометрии». Анальный биохим. 218 (2): 314–319. Дои:10.1006 / abio.1994.1184. PMID  8074286.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)