Белковый след - Protein footprinting

Белковый след это термин, используемый для обозначения метода биохимического анализа, который исследует структура белка, сборка и взаимодействие в более крупном макромолекулярная сборка. Первоначально он был придуман как ссылка на использование ограниченного протеолиза для исследования сайтов контакта в комплексе моноклональное антитело-белок-антиген.[1] и год спустя для изучения защиты от расщепления гидроксильными радикалами, обеспечиваемой белком, связанным с ДНК в составе комплекса ДНК-белок.[2] В ДНК-след Предполагается, что белок оставит отпечаток (или след ) в определенной точке взаимодействия.[3] Этот последний метод был адаптирован путем прямой обработки белков и их комплексов с гидроксил радикалы.[4][5]

Следы белков гидроксильных радикалов

Решенный во времени гидроксильный радикал белковый след с использованием масс-спектрометрии анализ был разработан в конце 1990-х гг. в синхротрон радиолизные исследования.[6][7] В том же году эти авторы сообщили об использовании электрический разряд источник для осуществления окисления белков в миллисекундных временных масштабах, когда белки проходят из раствора, подвергнутого электрораспылению, в масс-спектрометр.[8]Эти подходы с тех пор использовались для определения белковых структур,[9] сворачивание белков, динамика белков и белок-белковые взаимодействия.[10]

В отличие от нуклеиновых кислот, белки скорее окисляются, чем расщепляются в этих временных масштабах. Анализ продуктов с помощью масс-спектрометрии показывает, что белки окисляются ограниченным образом (около 10–30% от общего белка) по ряду боковых цепей аминокислот в белках. Скорость или уровень окисления боковых цепей реакционноспособных аминокислот (Met, Cys, Trp, Tyr, Phe, His, Pro и Leu) обеспечивает меру их доступности для основного растворителя. Механизмы окисления боковой цепи были исследованы путем проведения реакций радиолиза в 18О-меченная вода.

Производство радикалов ОН

Важной особенностью этих экспериментов является необходимость подвергать белки действию гидроксильных радикалов в течение ограниченного периода времени, порядка 1–50 мс, вызывая 10–30% окисление всего белка. Еще одним требованием является генерирование гидроксильных радикалов из основного растворителя (т.е. воды) (уравнения 1 и 2), а не перекиси водорода, которые могут оставаться для окисления белков даже без других стимулов.[11]

ЧАС2O → H2О+• + е− + H2О*
ЧАС2О+• + H2O → H3О+ + ОН•

Гидроксильные радикалы могут быть получены в растворе с помощью электрического разряда в обычном источнике ионизации электрораспылением при атмосферном давлении (ESI). Когда между иглой для электрораспыления и отверстием для отбора проб масс-анализатора поддерживается высокая разность напряжений (~ 8 кэВ), в растворе на кончике иглы для электрораспыления могут образовываться радикалы. Этот метод был первым, который применил протеиновый след для изучения белкового комплекса.[12]

Метод

Воздействие на белки «белого» рентгеновского луча синхротронного света или электрического разряда в течение десятков миллисекунд обеспечивает достаточную окислительную модификацию боковых цепей поверхностных аминокислот без повреждения структуры белка. Эти продукты можно легко обнаружить и количественно определить с помощью масс-спектрометрии. Регулируя время радиолиза или то, какие ионы белка проводят в источнике разряда, можно использовать подход с временным разрешением, который имеет ценность для изучения динамики белка.

Анализ

Компьютерная программа (PROXIMO) также была написана, чтобы помочь моделировать белковые комплексы, используя данные из подхода RP-MS / Protein footprinting.[13] RP-MS / Protein footprinting исследования белковых комплексов могут также использовать вычислительные подходы для помощи в этом моделировании.[14]

Приложения

Применение масс-спектрометрии ионной подвижности убедительно продемонстрировало, что условия, используемые в экспериментах по RP-MS / белковому отпечатку стопы, не изменяют структуру белков.[15]

Другие исследования расширили этот метод для изучения раннего начала повреждения белков, учитывая радикальную основу метода и значение радикалов на основе кислорода в патогенезе многих заболеваний, включая неврологические расстройства и даже слепоту.[16]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Шешберадаран, H; Л. Г. Пейн (1988). Футпринтинг «белковый антиген-моноклональное антитело», исследованные с помощью ограниченного протеолиза моноклонального антитела, связанного с антигеном: белок."". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 85 (1): 1–5. Bibcode:1988ПНАС ... 85 .... 1С. Дои:10.1073 / pnas.85.1.1. ЧВК  279469. PMID  2448767. Получено 2013-09-15.
  2. ^ Шафер Г.Е., Прайс М.А., Туллиус Т.Д. (1989). «Использование гидроксильного радикала и гель-электрофореза для изучения структуры ДНК». Электрофорез. 10 (5–6): 397–404. Дои:10.1002 / elps.1150100518. PMID  2504579.
  3. ^ Галас, Дэвид Дж (2001). «Изобретение отпечатков пальцев». Тенденции в биохимических науках. 26 (11): 690–693. Дои:10.1016 / S0968-0004 (01) 01979-X. ISSN  0968-0004. PMID  11701330.
  4. ^ Maleknia, Simin D .; Даунард, Кевин М. (2014). «Достижения в масс-спектрометрии с радикальными зондами для определения следа белков в приложениях химической биологии». Обзоры химического общества. 43 (10): 3244–3258. Дои:10.1039 / C3CS60432B. PMID  24590115.
  5. ^ Ван, Ливен; Шанс, Марк Р. (2011). «Структурная масс-спектрометрия белков с использованием футпринтинга белков на основе гидроксильных радикалов». Аналитическая химия. 83 (19): 7234–7241. Дои:10.1021 / ac200567u. ISSN  0003-2700. ЧВК  3184339. PMID  21770468.
  6. ^ Maleknia, Simin D .; Бреновиц, Майкл; Шанс, Марк Р. (1999). «Миллисекундная радиолитическая модификация пептидов с помощью синхротронного рентгеновского излучения, идентифицированного масс-спектрометрией». Аналитическая химия. 71 (18): 3965–3973. Дои:10.1021 / ac990500e. ISSN  0003-2700. PMID  10500483.
  7. ^ Maleknia, Simin D .; Ralston, Corie Y .; Бреновиц, Майкл Д .; Даунард, Кевин М .; Шанс, Марк Р. (2001). "Определение складчатости и структуры макромолекул методами синхротронного рентгеновского радиолиза". Аналитическая биохимия. 289 (2): 103–115. Дои:10.1006 / abio.2000.4910. ISSN  0003-2697. PMID  11161303.
  8. ^ Maleknia, Simin D .; Chance, Mark R .; Даунард, Кевин М. (1999). «Модификация белков с помощью электрораспыления: радикальный зонд структуры белка». Быстрые коммуникации в масс-спектрометрии. 13 (23): 2352–2358. Bibcode:1999RCMS ... 13.2352M. Дои:10.1002 / (SICI) 1097-0231 (19991215) 13:23 <2352 :: AID-RCM798> 3.0.CO; 2-X. ISSN  0951-4198. PMID  10567934.
  9. ^ Maleknia, Simin D .; Киселар, Жанна Г .; Даунард, Кевин М. (2002). «Зонд гидроксильных радикалов поверхности лизоцима с помощью синхротронного радиолиза и масс-спектрометрии». Быстрые коммуникации в масс-спектрометрии. 16 (1): 53–61. Bibcode:2002RCMS ... 16 ... 53M. Дои:10.1002 / rcm.543. ISSN  0951-4198. PMID  11754247.
  10. ^ Maleknia, Simin D .; Даунард, Кевин М. (2001). «Радикальные подходы к исследованию структуры белка, сворачивания и взаимодействий с помощью масс-спектрометрии». Обзоры масс-спектрометрии. 20 (6): 388–401. Bibcode:2001MSRv ... 20..388M. Дои:10.1002 / mas.10013. ISSN  0277-7037. PMID  11997945.
  11. ^ Кевин Даунард (24 августа 2007 г.). Масс-спектрометрия белковых взаимодействий.. Джон Уайли и сыновья. ISBN  978-0-470-14632-3. Получено 14 сентября 2013.
  12. ^ Вонг, Джейсон В. Х .; Maleknia, Simin D .; Даунард, Кевин М. (2003). "Изучение комплекса рибонуклеаза-S-белок-пептид с использованием радикального зонда и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением". Аналитическая химия. 75 (7): 1557–1563. Дои:10.1021 / ac026400h. ISSN  0003-2700. PMID  12705585.
  13. ^ Герега, С.К .; Даунард, К. М. (2006). «PROXIMO - новый алгоритм стыковки для моделирования белковых комплексов с использованием данных масс-спектрометрии радикального зонда (RP-MS)». Биоинформатика. 22 (14): 1702–1709. Дои:10.1093 / биоинформатика / btl178. ISSN  1367-4803. PMID  16679333.
  14. ^ Даунард, Кевин М .; Кокабу, Юичи; Икегучи, Мицунори; Акаси, Сатоко (2011). «Гомологически смоделированная структура гетеродимера βB2B3-кристаллина, изученная с помощью ионной подвижности и радикального зонда MS». Журнал FEBS. 278 (21): 4044–4054. Дои:10.1111 / j.1742-4658.2011.08309.x. ISSN  1742-464X. PMID  21848669.
  15. ^ Даунард, Кевин М .; Maleknia, Simin D .; Акаси, Сатоко (2012). «Влияние ограниченного окисления на подвижность иона протеина и структуру важно для отпечатков с помощью масс-спектрометрии радикального зонда». Быстрые коммуникации в масс-спектрометрии. 26 (3): 226–230. Дои:10.1002 / rcm.5320. ISSN  0951-4198. PMID  22223306.
  16. ^ Шум, Вай-Кей; Maleknia, Simin D .; Даунард, Кевин М. (2005). «Начало окислительного повреждения α-кристаллина методом радикальной масс-спектрометрии». Аналитическая биохимия. 344 (2): 247–256. Дои:10.1016 / j.ab.2005.06.035. ISSN  0003-2697. PMID  16091281.