Водородно-дейтериевый обмен - Hydrogen–deuterium exchange

Водородно-дейтериевый обмен (также называемый H – D или H / D обменом) является химическая реакция в котором ковалентно связанный водород атом заменяется на дейтерий атом, или наоборот. Его проще всего применить к обмениваемым протонам и дейтронам, где такое превращение происходит в присутствии подходящего источника дейтерия без какого-либо катализатора. Использование кислотных, основных или металлических катализаторов в сочетании с условиями повышенной температуры и давления может облегчить обмен незаменяемыми атомами водорода при условии, что субстрат устойчив к условиям и используемым реагентам. Это часто приводит к пердейтерированию: обмену между водородом и дейтерием всех необмениваемых атомов водорода в молекуле.

Примером обмениваемых протонов, которые обычно исследуют таким образом, являются протоны амиды в хребте белок.[1][2][3] Метод дает информацию о растворитель доступность различных частей молекулы и, следовательно, третичная структура белка. Теоретические основы понимания водородного обмена в белках были впервые описаны Кай Ульрик Линдерстрём-Ланг и он был первым, кто применил H / D обмен для изучения белков.[4]

Обменная реакция

В протонном растворе обменные протоны, такие как протоны в гидроксильной или аминогруппе, обмениваются протонами с растворитель. Если D2O - растворитель, дейтроны будут включены в эти позиции. За реакцией обмена можно следить, используя множество методов (см. Обнаружение). Поскольку этот обмен является равновесной реакцией, молярное количество дейтерия должно быть высоким по сравнению с обмениваемыми протонами субстрата. Например, дейтерий добавляется к белку в H2O путем разбавления H2Решение O с D2О (например, десятикратно). Обычно обмен осуществляется при физиологическом pH (7,0–8,0), когда белки находятся в своем наиболее естественном ансамбле конформационных состояний.[5][6]

Реакция обмена H / D может также катализироваться кислотными, основными или металлическими катализаторами, такими как платина. Для амидных атомов водорода основной цепи белков минимальная скорость обмена наблюдается в среднем при pH 2,6. Выполняя обмен при нейтральном pH и затем быстро меняя pH, можно резко снизить скорость обмена амидных атомов водорода основной цепи или закаленный. PH, при котором реакция гасится, зависит от метода анализа. Для обнаружения с помощью ЯМР значение pH можно довести до 4,0–4,5. Для обнаружения методом масс-спектрометрии значение pH снижают до минимума кривой обмена, pH 2,6. В самом простом эксперименте реакции дают возможность протекать в течение определенного времени, прежде чем ее гаснут.

Паттерн дейтерирования молекулы, подвергшейся H / D обмену, может сохраняться в апротонных средах. Однако некоторые методы анализа дейтерирования таких молекул, как белки, выполняются в водном растворе, что означает, что обмен будет продолжаться с медленной скоростью даже после того, как реакция будет погашена. Нежелательный дейтерий-водородный обмен называется обратный обмен и были разработаны различные методы, чтобы исправить это.

Обнаружение

Обмен H – D был первоначально измерен отцом водородного обмена. Кай Ульрик Линдерстрём-Ланг используя трубки градиента плотности. В наше время обмен H – D в основном отслеживается следующими методами: ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрии и нейтронная кристаллография. У каждого из этих методов есть свои преимущества и недостатки.

ЯМР-спектроскопия

Водород и дейтерий ядра сильно различаются по своим магнитным свойствам. Таким образом, их можно различать по ЯМР-спектроскопия. Дейтроны не будут наблюдаться в 1Спектр ЯМР 1Н и, наоборот, протоны не будут наблюдаться в 2Спектр ЯМР 1Н. Если небольшие сигналы наблюдаются в 1Спектр ЯМР 1Н образца с высокой степенью дейтерирования, они называются остаточными сигналами. Их можно использовать для расчета уровня дейтерирования в молекуле. Аналогичные сигналы не наблюдаются в 2Спектры ЯМР 1Н из-за низкой чувствительности этого метода по сравнению с 1H анализ. Дейтроны обычно демонстрируют очень похожие химические сдвиги с аналогичными протонами. Анализ через 13Возможна также спектроскопия ЯМР 13С: разные значения спина водорода (1/2) и дейтерия (1) вызывают разную кратность расщепления. ЯМР-спектроскопия может использоваться для определения сайт-специфичного дейтерирования молекул.

Другой метод использует спектры HSQC. Обычно HSQC спектры записываются в серию моментов времени, когда водород обменивается с дейтерием. Поскольку эксперимент HSQC специфичен для водорода, сигнал будет экспоненциально затухать по мере обмена водорода. Затем можно подобрать экспоненциальную функцию к данным и получить константу обмена. Этот метод дает остаток -специфическая информация для всех остатков в белке одновременно[7][8] Главный недостаток состоит в том, что для этого требуется предварительное определение спектра рассматриваемого белка. Это может быть очень трудоемким и обычно ограничивает метод белками меньше 25. кДа. Поскольку запись спектра HSQC занимает от нескольких минут до часов, амиды с быстрым обменом необходимо измерять с использованием других импульсных последовательностей.

Масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия с водородно-дейтериевым обменом может определить общее содержание дейтерия в молекулах, подвергшихся обмену H / D. Из-за необходимой подготовки образца обычно считается, что он обеспечивает точное измерение только незаменяемых атомов водорода. Он также может включать H / D обмен в газовой фазе.[9] или фазовый обмен раствора перед ионизацией.[3] Он имеет несколько преимуществ в ЯМР-спектроскопии по сравнению с анализом реакций обмена H – D: требуется гораздо меньше материала, концентрация образца может быть очень низкой (всего 0,1 мкМ), предел размера намного больше, и данные могут быть обычно собираются и интерпретируются гораздо быстрее.[10]

Ядро дейтерия вдвое тяжелее ядра водорода, поскольку оно содержит нейтрон а также протон. Таким образом, молекула, содержащая некоторое количество дейтерия, будет тяжелее, чем молекула, содержащая весь водород. Поскольку белок становится все более дейтерированным, молекулярная масса соответственно увеличивается. Обнаружение изменения массы белка при дейтерировании стало возможным благодаря современной масс-спектрометрии белков, о которой впервые сообщили в 1991 г. Катта и Чайт.[11]

Определение сайт-специфического дейтерирования с помощью масс-спектрометрии более сложно, чем с помощью ЯМР-спектроскопии. Например, местоположение и относительное количество обмена дейтерия вдоль пептидного остова можно приблизительно определить, подвергая белок протеолизу после того, как реакция обмена была погашена. Затем отдельные пептиды анализируют на общую дейтерированность каждого пептидного фрагмента. При использовании этого метода разрешение обмена дейтерия определяется размером пептидов, образующихся в процессе пищеварения.[12] Пепсин, кислота протеаза, обычно используется для протеолиза, поскольку во время протеолитической реакции необходимо поддерживать pH гашения. Чтобы свести к минимуму обратный обмен, протеолиз и последующий масс-спектрометрический анализ должны выполняться как можно быстрее. ВЭЖХ отделение пептического гидролизата часто проводят при низкой температуре непосредственно перед электрораспылительная масс-спектрометрия минимизировать обратный обмен. В последнее время, UPLC был использован из-за его превосходных возможностей разделения.[13]

В 1999 г. было высказано предположение, что можно было бы достичь разделения по одному остатку, используя диссоциация, вызванная столкновением (CID) фрагментация дейтерированных пептидов в сочетании с тандемная масс-спектрометрия. Вскоре было обнаружено, что CID вызывает «замешательство» положения дейтерия в пептидах.[14][15] Однако фрагментация, вызванная МАЛДИ затухание в источнике (ISD), диссоциация электронного захвата (ECD) и диссоциация с переносом электрона (ETD) при правильных экспериментальных условиях выполняются с минимальным скремблированием или без него.[16][17][18] Скремблирование изотопного мечения вызывается столкновительным нагревом перед диссоциацией иона, и хотя CID действительно вызывает скремблирование, столкновительный нагрев может также происходить во время ионизации и переноса ионов.[19] Однако путем тщательной оптимизации параметров прибора, которые вызывают нагрев ионов, водородное скремблирование может быть минимизировано до степени, при которой сохраняется изотопное мечение фазы раствора до тех пор, пока фрагментация не может быть выполнена с использованием техники, в которой скремблирование не происходит.[17][18][20][21] Это говорит о том, что в конечном итоге можно будет добиться разделения реакций обмена H / D на один остаток на рутинной основе.

Нейтронная кристаллография

Обмен между водородом и дейтерием быстро обменивающихся частиц (например, гидроксильных групп) может быть измерен с атомным разрешением количественно с помощью нейтронной кристаллографии и в реальном времени, если обмен проводится во время дифракционного эксперимента.

Пучки нейтронов высокой интенсивности обычно генерируются раскол на линейных ускорителях частиц, таких как Источник нейтронов расщепления. Нейтроны дифрагируют кристаллы подобно рентгеновским лучам и могут использоваться для определения структуры. Атомы водорода с числом электронов от одного до нуля в биологических условиях плохо дифрагируют рентгеновские лучи и практически невидимы в нормальных экспериментальных условиях. Нейтроны рассеиваются от атомных ядер и поэтому способны обнаруживать атомы водорода и дейтерия.

Атомы водорода обычно заменяются дейтерием, что приводит к сильному положительному коэффициенту рассеяния. Часто достаточно заменить только растворитель и лабильные атомы водорода в кристалле белка диффузией пара. В такой структуре степень заполнения обмениваемого атома дейтерия в кристалле будет уменьшаться от 0 до 100%, что напрямую определяет количество обмена.

Приложения

Рассеяние нейтронов

Пердейтерирование одного компонента многокомпонентной системы может обеспечить контраст для рассеяние нейтронов эксперименты, в которых контраст, полученный с использованием дейтерированных растворителей, недостаточен.[нужна цитата ]

Белковая структура

Невозможно определить структуру белка с обменом H / D, кроме нейтронной кристаллографии, а также невозможно определить вторичные структурные элементы. Причины этого связаны с тем, как структура белка замедляет обмен. Скорость обмена является функцией двух параметров: доступности растворителя и водородных связей. Таким образом, амид, входящий в состав внутримолекулярного водородная связь будет обмениваться медленно, если вообще будет, тогда как амид на поверхности белка, водородно связанного с водой, будет быстро обмениваться. Амиды, захороненные в растворителе, но не связанные водородными связями, также могут иметь очень низкие скорости обмена. Поскольку и доступность растворителя, и водородные связи влияют на скорость обмена, становится трудно приписать данную скорость обмена структурному элементу без кристаллография или структурные данные ЯМР.

Обмен H – D был использован для характеристики складывание путь белков путем рефолдинга белка в условиях обмена. В эксперименте по прямому обмену (с H на D) импульс дейтерия добавляется после различных периодов времени рефолдинга. Части структуры, которые образуются быстро, будут защищены и, таким образом, не будут заменены, тогда как области, которые складываются в конце пути, будут подвергаться обмену в течение более длительных периодов времени. Таким образом, обмен H / D может использоваться для определения последовательности различных событий сворачивания. Факторами, определяющими временное разрешение этого подхода, являются эффективность смешивания и то, как быстро можно выполнить закалку после этикетирования.

Обмен H – D был использован для характеристики белковых структур.[22] и белок-белковые взаимодействия.[23] Реакцию обмена необходимо проводить с изолированными белками и с комплексом. Затем сравниваются обменивающиеся регионы. Если область скрыта за счет связывания, амиды в этой области могут быть защищены в комплексе и обмениваться медленно. Однако необходимо иметь в виду, что обмен H – D не может использоваться для определения границ связывания для всех взаимодействий белок-белок. Некоторые белок-белковые взаимодействия управляются электростатическими силами боковых цепей и вряд ли изменят скорость обмена амидных водородов основной цепи, особенно если амидные водороды расположены в стабильных структурных элементах, таких как альфа спирали.

Наконец, обмен H – D может использоваться для мониторинга конформационных изменений белков, поскольку они связаны с функцией белка. Если внешность изменилась в результате посттрансляционная модификация, активация ферментов, связывание лекарств или другие функциональные события, вероятно, произойдет изменение обмена H / D, которое может быть обнаружено.[24]

HDXsite

HDXsite включает в себя несколько приложений для увеличения разрешения экспериментальных данных HDX. (https://hdxsite.nms.kcl.ac.uk/ )

Рекомендации

  1. ^ Englander, SW; Мейн, Л. (1992-06-01). «Сворачивание белков, изученное с использованием водородообменного мечения и двумерного ЯМР». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул. 21 (1): 243–265. Дои:10.1146 / annurev.bb.21.060192.001331. ISSN  1056-8700. PMID  1525469.
  2. ^ Englander, S Walter; Сосник, Тобин Р.; Englander, Joan J; Мэйн, Лиланд (февраль 1996). «Механизмы и использование водородного обмена». Текущее мнение в структурной биологии. 6 (1): 18–23. Дои:10.1016 / s0959-440x (96) 80090-x. ISSN  0959-440X. ЧВК  3412065. PMID  8696968.
  3. ^ а б Конерманн Л., Пан Дж., Лю Ю. Х. (март 2011 г.). «Водородообменная масс-спектрометрия для изучения структуры и динамики белков». Обзоры химического общества. 40 (3): 1224–34. Дои:10.1039 / C0CS00113A. PMID  21173980.
  4. ^ Englander SW, Mayne L, Bai Y, Sosnick TR (май 1997 г.). «Водородный обмен: современное наследие Линдерстрём-Ланг». Белковая наука. 6 (5): 1101–9. Дои:10.1002 / pro.5560060517. ЧВК  2143687. PMID  9144782.
  5. ^ Englander SW, Kallenbach NR (ноябрь 1983 г.). «Водородный обмен и структурная динамика белков и нуклеиновых кислот». Ежеквартальные обзоры биофизики. 16 (4): 521–655. Дои:10.1017 / S0033583500005217. PMID  6204354.
  6. ^ Джонсон Р.С., Уолш К.А. (декабрь 1994 г.). «Масс-спектрометрическое измерение белкового амид-водородного обмена апо- и голо-миоглобина». Белковая наука. 3 (12): 2411–2418. Дои:10.1002 / pro.5560031224. ЧВК  2142783. PMID  7756994.
  7. ^ Демура М (2006). «Понимание ЯМР структурной стабильности и сворачивания кальций-связывающего лизоцима». В Webb GA (ред.). Современный магнитный резонанс. Дордрехт: Спрингер. С. 497–501. Дои:10.1007/1-4020-3910-7_62. ISBN  978-1-4020-3894-5.
  8. ^ Чандак М.С., Накамура Т., Макабе К., Такенака Т., Мукаяма А., Чаудхури Т.К. и др. (Июль 2013). «Кинетика H / D-обмена co-chaperonin GroES Escherichia coli изучена методами 2D ЯМР и DMSO-quenched-обмена». Журнал молекулярной биологии. 425 (14): 2541–60. Дои:10.1016 / j.jmb.2013.04.008. PMID  23583779.
  9. ^ Стюарт Дж. Х., Шапиро Р. Х., Депуи СН, Бирбаум В. Х. (1977). «Реакции водородно-дейтериевого обмена карбанионов с водой-d2 в газовой фазе». Журнал Американского химического общества. 99 (23): 7650–3. Дои:10.1021 / ja00465a037.
  10. ^ Уэльс Т.Э., Энген-младший (2006). «Водородообменная масс-спектрометрия для анализа динамики белков». Обзоры масс-спектрометрии. 25 (1): 158–70. Bibcode:2006MSRv ... 25..158Вт. Дои:10.1002 / mas.20064. PMID  16208684.
  11. ^ Katta V, Chait BT (апрель 1991 г.). «Конформационные изменения в белках, исследованные с помощью масс-спектрометрии с электрораспылением и ионизацией водорода». Быстрые коммуникации в масс-спектрометрии. 5 (4): 214–7. Bibcode:1991RCMS .... 5..214K. Дои:10.1002 / RCM.1290050415. PMID  1666528.
  12. ^ Zhang Z, Smith DL (апрель 1993 г.). «Определение амидного водородного обмена с помощью масс-спектрометрии: новый инструмент для выяснения структуры белков». Белковая наука. 2 (4): 522–31. Дои:10.1002 / pro.5560020404. ЧВК  2142359. PMID  8390883.
  13. ^ Wales TE, Fadgen KE, Gerhardt GC, Engen JR (сентябрь 2008 г.). «Высокоскоростное разделение UPLC с высоким разрешением при нулевых градусах Цельсия». Аналитическая химия. 80 (17): 6815–20. Дои:10.1021 / ac8008862. ЧВК  2562353. PMID  18672890.
  14. ^ Jørgensen TJ, Gårdsvoll H, Ploug M, Roepstorff P (март 2005 г.). «Внутримолекулярная миграция амидных атомов водорода в протонированных пептидах при столкновительной активации». Журнал Американского химического общества. 127 (8): 2785–93. Дои:10.1021 / ja043789c. PMID  15725037.
  15. ^ Jørgensen TJ, Bache N, Roepstorff P, Gårdsvoll H, Ploug M (декабрь 2005 г.). «Коллизионная активация тандемной времяпролетной масс-спектрометрией MALDI вызывает внутримолекулярную миграцию амидных водородов в протонированных пептидах». Молекулярная и клеточная протеомика. 4 (12): 1910–9. Дои:10.1074 / mcp.M500163-MCP200. PMID  16127176.
  16. ^ Бач Н., Рэнд К.Д., Рёпсторфф П., Йоргенсен Т.Дж. (август 2008 г.). «Газофазная фрагментация пептидов распадом MALDI в источнике с ограниченным скремблированием амидного водорода (1H / 2H)». Аналитическая химия. 80 (16): 6431–5. Дои:10.1021 / ac800902a. PMID  18642878.
  17. ^ а б Рэнд К.Д., Адамс К.М., Зубарев Р.А., Йоргенсен Т.Дж. (январь 2008 г.). «Диссоциация с захватом электронов протекает с низкой степенью внутримолекулярной миграции атомов водорода пептидных амидов». Журнал Американского химического общества. 130 (4): 1341–9. Дои:10.1021 / ja076448i. PMID  18171065.
  18. ^ а б Zehl M, Rand KD, Jensen ON, Jørgensen TJ (декабрь 2008 г.). «Диссоциация с переносом электронов облегчает измерение включения дейтерия в селективно меченые пептиды с разрешением по одному остатку». Журнал Американского химического общества. 130 (51): 17453–9. Дои:10.1021 / ja805573h. PMID  19035774.
  19. ^ Рэнд К.Д., Зель М., Йоргенсен Т.Дж. (октябрь 2014 г.). «Измерение водородно-дейтериевого обмена белков с высоким пространственным разрешением с помощью масс-спектрометрии: преодоление газофазного водородно-дейтериевого скремблирования». Отчеты о химических исследованиях. 47 (10): 3018–27. Дои:10.1021 / ar500194w. PMID  25171396.
  20. ^ Wollenberg DT, Pengelley S, Mouritsen JC, Suckau D, Jørgensen CI, Jørgensen TJ (июнь 2020 г.). «Предотвращение H / D-скремблирования с минимальными потерями при передаче ионов для анализа HDX-MS / MS-ETD на масс-спектрометре Q-TOF высокого разрешения». Аналитическая химия. 92 (11): 7453–7461. Дои:10.1021 / acs.analchem.9b05208. PMID  32427467.
  21. ^ Рэнд К.Д., Прингл С.Д., Моррис М., Энген Дж. Р., Браун Дж. М. (октябрь 2011 г.). «ETD в ионопроводе бегущей волны при настроенных условиях источника ионов Z-спрея позволяет проводить измерения обмена водорода / дейтерия на конкретном участке». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 22 (10): 1784–93. Bibcode:2011JASMS..22.1784R. Дои:10.1007 / s13361-011-0196-7. ЧВК  3438897. PMID  21952892.
  22. ^ Уайт М.Р., Хан М.М., Дередж Д., Росс С.Р., Квинтин Р., Цуккони Б.Е., Высоцкий В.Х., Винтроде П.Л., Уилсон Г.М., Гарсин Е.Д. (январь 2015 г.). «Мутация интерфейса димера в глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе регулирует его связывание с AU-богатой РНК». Журнал биологической химии. 290 (3): 1770–85. Дои:10.1074 / jbc.M114.618165. ЧВК  4340419. PMID  25451934.
  23. ^ Манделл Дж. Г., Баерга-Ортис А., Фалик А. М., Комивес Е. А. (2005). Измерение доступности растворителя на границе раздела белок-белок. Методы молекулярной биологии. 305. С. 65–80. Дои:10.1385/1-59259-912-5:065. ISBN  1-59259-912-5. PMID  15939994.
  24. ^ Гутман М., Купо А., Жюльен Дж. П., Сандерс Р. У., Уилсон И. А., Мур Дж. П., Ли К. К. (февраль 2015 г.). «Эффективность антител связана со способностью распознавать закрытую форму Env ВИЧ до слияния». Nature Communications. 6: 6144. Bibcode:2015 НатКо ... 6,6144 г. Дои:10.1038 / ncomms7144. ЧВК  4338595. PMID  25652336.

дальнейшее чтение

  • Дэвид Вайс, Эд. (2016). Водородообменная масс-спектрометрия белков: основы, методы и приложения. Нью-Йорк: Вили. ISBN  9781118616499.