Нозерн-блот - Northern blot

Блок-схема, описывающая общую процедуру обнаружения РНК с помощью нозерн-блоттинга.

В северное пятно, или РНК-блот,[1] это техника, используемая в молекулярная биология исследования для изучения экспрессия гена путем обнаружения РНК (или изолированные мРНК ) в образце.[2][3]

С помощью Нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией, определяя скорость экспрессии конкретных генов во время дифференцировки и морфогенез, а также в ненормальных или патологических условиях.[4] Нозерн-блоттинг предполагает использование электрофорез для разделения образцов РНК по размеру и обнаружения с помощью гибридизационный зонд комплементарен части или всей целевой последовательности. Термин «нозерн-блот» на самом деле относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют Нозерн-блоттингом.[5] Техника северного блоттинга была разработана в 1977 году Джеймсом Олвином, Дэвид Кемп и Джордж Старк в Стэндфордский Университет,[6] при участии Герхарда Генриха. Нозерн-блоттинг получил свое название от его сходства с первым методом блоттинга. Саузерн-блот, названный в честь биолога Эдвин Южный.[2] Основное отличие состоит в том, что РНК, а не ДНК, анализируется в северном блоте.[7]

Процедура

Общая процедура блоттинга[5] начинается с выделения общей РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем мРНК эукариот можно выделить с помощью олиго (dT) целлюлозы. хроматография изолировать только те РНК с поли (А) хвост.[8][9] Затем образцы РНК разделяют гель-электрофорезом. Поскольку гели хрупкие, а зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносятся на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.

Установка системы капиллярного блоттинга для переноса РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга.

Нейлоновая мембрана с положительным зарядом является наиболее эффективной для использования в Нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к ним. Буфер для переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид потому что он снижает температуру отжига взаимодействия зонд-РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК.[10] После того, как РНК была перенесена на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-света или тепла. После того, как зонд был помечен, он гибридизуется с РНК на мембране. Условия экспериментов, которые могут влиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований.[11] Мембрану промывают, чтобы обеспечить специфическое связывание зонда и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Затем гибридные сигналы обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть количественно определены с помощью денситометрия. Для создания контролей для сравнения в Нозерн-блоте образцы, не отображающие интересующий генный продукт, могут быть использованы после определения микрочипы или же ОТ-ПЦР.[11]

Гели

РНК проходит на формальдегидном агарозном геле, чтобы выделить 28S (верхняя полоса) и 18S (нижняя полоса) рибосомные субъединицы.

Образцы РНК чаще всего разделяют на агароза гели, содержащие формальдегид как денатурирующий агент для РНК для ограничения вторичной структуры.[11][12] Гели можно окрашивать этидиум бромид (EtBr) и просматривают в УФ-свете для наблюдения за качеством и количеством РНК перед блоттингом.[11] Полиакриламид гель-электрофорез с мочевина также может использоваться для разделения РНК, но чаще всего используется для фрагментированной РНК или микроРНК.[13] РНК-лестницу часто проводят рядом с образцами на геле для электрофореза, чтобы наблюдать размер полученных фрагментов, но в образцах общей РНК субъединицы рибосом могут действовать как маркеры размера.[11] Поскольку большая рибосомная субъединица - это 28S (приблизительно 5kb), а малая рибосомная субъединица - это 18S (приблизительно 2kb), на геле появляются две заметные полосы, большая примерно в два раза интенсивнее меньшей.[11][14]

Зонды

Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной всей или части представляющей интерес РНК, они могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотидами с минимум 25 основаниями, комплементарными целевой последовательности.[5] РНК-зонды (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая некоторый фоновый шум.[11] Обычно кДНК создают с помощью меченых праймеров для интересующей последовательности РНК, чтобы действовать как зонд в нозерн-блоттинге.[15] Зонды должны быть помечены радиоактивными изотопами (32P) или с хемилюминесценция в котором щелочная фосфатаза или же пероксидаза хрена (HRP) разрушает хемилюминесцентные субстраты, производя заметное излучение света.[16] Хемилюминесцентное мечение может происходить двумя способами: либо зонд присоединяется к ферменту, либо зонд помечается лигандом (например, биотин ), для которого лиганд (например, авидин или же стрептавидин ) присоединяется к ферменту (например, HRP).[11] Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, потому что они быстрее, более чувствительны и уменьшают опасность для здоровья, связанную с радиоактивными метками.[16] Одна и та же мембрана может быть исследована до пяти раз без значительной потери целевой РНК.[10]

Приложения

Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать характер экспрессии определенного гена между тканями, органами, стадиями развития, уровнями экологического стресса, инфекцией патогенов и в ходе лечения.[9][15][17] Этот метод был использован для демонстрации сверхэкспрессии онкогенов и подавления экспрессии генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальной» тканью.[11] а также экспрессия генов при отторжении пересаженных органов.[18] Если повышенная регуляция гена наблюдается по обилию мРНК на нозерн-блоте, образец можно затем секвенировать, чтобы определить, известен ли ген исследователям или это новое открытие.[18] Паттерны экспрессии, полученные в данных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, разница в уровне каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предлагая альтернативные продукты сплайсинга того же гена или повторяющиеся мотивы последовательностей.[8][14] Различия в размере продукта гена также могут указывать на делеции или ошибки в обработке транскриптов. Изменяя зонд-мишень, используемый вдоль известной последовательности, можно определить, какая область РНК отсутствует.[2]

Преимущества и недостатки

Анализ экспрессии генов может быть выполнен несколькими различными методами, включая ОТ-ПЦР, тесты защиты от РНКаз, микроматрицы, РНК-Seq, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг.[4][5] Микроматрицы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью Нозерн-блотов; однако иногда нозерн-блоттинг может обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, которые не могут быть обнаружены с помощью микроматриц.[19] Преимущество микроматриц перед нозерн-блоттингом состоит в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, тогда как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов.[17][19]

Проблемой Нозерн-блоттинга часто является разложение образца РНКазами (как эндогенными для образца, так и из-за загрязнения окружающей среды), чего можно избежать путем надлежащей стерилизации стеклянной посуды и использования ингибиторов РНКаз, таких как DEPC (диэтилпирокарбонат ).[5] Химические вещества, используемые в большинстве северных пятен, могут представлять опасность для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивный материал, бромид этидия, DEPC и УФ-свет вредны при определенных воздействиях.[11] По сравнению с ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг имеет низкую чувствительность, но он также имеет высокую специфичность, что важно для уменьшения количества ложноположительных результатов.[11]

Преимущества использования Нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение за альтернативными продуктами сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле до блоттинга, а мембраны можно хранить. и осуждался годами после промокания.[11]

Для северного блоттинга для обнаружения ацетилхолинэстераза мРНК нерадиоактивный метод был сравнен с радиоактивным методом и был признан таким же чувствительным, как и радиоактивный, но не требует защиты от излучения и требует меньше времени.[20]

Обратное северное пятно

Иногда исследователи используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блот. В этой процедуре нуклеиновая кислота субстрата (которая прикреплена к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд представляет собой РНК, выделенную из ткани и радиоактивно меченную. ДНК-микрочипы которые получили широкое распространение в конце 1990-х и начале 2000-х годов, больше похожи на обратную процедуру, поскольку они включают использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, созданным из клеточной РНК. Таким образом, обратная процедура, хотя изначально необычная, позволила северному анализу развиться в профилирование экспрессии генов, в котором можно отслеживать экспрессию многих (возможно, всех) генов в организме.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Гилберт, С. Ф. (2000) Биология развития, 6-е изд. Сандерленд, Массачусетс, Sinauer Associates.
  2. ^ а б c Альбертс, Б., Джонсон, А., Льюис, Дж. Рафф, М., Робертс, К., Уолтер, П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, стр. 538–539.
  3. ^ Кевил, К. Г., Уолш, Л., Лару, Ф. С., Калогерис, Т., Гришем, М. Б., Александер, Дж. С. (1997) Улучшенный быстрый северный протокол. Biochem. и Biophys. Research Comm. 238: 277–279.
  4. ^ а б Schlamp, K .; Weinmann, A .; Krupp, M .; Maass, T .; Galle, P.R .; Тойфель, А. (2008). «BlotBase: база данных Нозерн-блотов». Ген. 427 (1–2): 47–50. Дои:10.1016 / j.gene.2008.08.026. PMID  18838116.
  5. ^ а б c d е Трейхурн П. (1996) Нозерн-блоттинг. Pro. Nutrition Soc. 55: 583–589.
  6. ^ Алвин Дж. К., Кемп Д. Д., Старк Г. Р. (1977). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметилбумагу и гибридизации с ДНК-зондами». Proc. Natl. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 74 (12): 5350–4. Дои:10.1073 / пнас.74.12.5350. ЧВК  431715. PMID  414220.
  7. ^ Bor, Y.C .; Swartz, J .; Li, Y .; Coyle, J .; Рекош, Д .; Хаммаршельд, Мария-Луиза (2006). «Нозерн-блоттинг мРНК из полирибосом млекопитающих». Протоколы природы. Дои:10.1038 / nprot.2006.216.
  8. ^ а б Durand, G.M .; Зукин, Р. С. (1993). «Регуляция развития мРНК, кодирующих рецепторы Kainate / AMPA мозга крысы: исследование северного анализа». J. Neurochem. 61 (6): 2239–2246. Дои:10.1111 / j.1471-4159.1993.tb07465.x. PMID  8245974.
  9. ^ а б Mori, H .; Takeda-Yoshikawa, Y .; Хара-Нисимура, I .; Нисимура, М. (1991). «Клонирование малатсинтазы тыквы и секвенирование кДНК и Нозерн-блоттинг». Евро. J. Biochem. 197 (2): 331–336. Дои:10.1111 / j.1432-1033.1991.tb15915.x. PMID  1709098.
  10. ^ а б Ян, H .; McLeese, J .; Weisbart, M .; Dionne, J.-L .; Lemaire, I .; Обен, Р. А. (1993). «Упрощенный протокол высокой пропускной способности для северной гибридизации». Исследования нуклеиновых кислот. 21 (14): 3337–3338. Дои:10.1093 / nar / 21.14.3337. ЧВК  309787. PMID  8341618.
  11. ^ а б c d е ж грамм час я j k л Streit, S .; Michalski, C.W .; Эркан, М .; Kleef, J .; Фрисс, Х. (2009). «Нозерн-блоттинг для обнаружения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Протоколы природы. 4 (1): 37–43. Дои:10.1038 / nprot.2008.216. PMID  19131955.
  12. ^ Yamanaka, S .; Поксай, К. С .; Арнольд, К. С .; Иннерарити, Т. Л. (1997). «Новая мРНК репрессора трансляции широко редактируется в печени, содержащей опухоли, вызванные экспрессией трансгена фермента редактирования мРНК апоВ». Genes Dev. 11 (3): 321–333. Дои:10.1101 / gad.11.3.321. PMID  9030685.
  13. ^ Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z. (2004) Чувствительное и специфическое обнаружение микроРНК методом нозерн-блоттинга с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидных зондов. Nuc. Исследования кислот. 32: e175.
  14. ^ а б Гортнер, Г .; Pfenninger, M .; Kahl, G .; Вайзинг, К. (1996). «Нозерн-блоттинг простой повторяющейся транскрипции последовательности в растениях». Электрофорез. 17 (7): 1183–1189. Дои:10.1002 / elps.1150170702. PMID  8855401.
  15. ^ а б Лян, П. Парди, А. Б. (1995) Последние достижения в области дифференциального отображения. Current Opinion Immunol. 7: 274–280.
  16. ^ а б Engler-Blum, G .; Meier, M .; Франк, Дж .; Мюллер, Г. А. (1993). «Уменьшение фоновых проблем в нерадиоактивном Нозерн-блоттинге и Саузерн-блоттинге обеспечивает более высокую чувствительность, чем гибридизации на основе 32P». Анальный. Биохим. 210 (2): 235–244. Дои:10.1006 / abio.1993.1189. PMID  7685563.
  17. ^ а б Болдуин, Д., Крейн, В., Райс, Д. (1999) Сравнение гелевых, нейлоновых фильтров и методов микроматрицы для обнаружения дифференциальной экспрессии РНК в растениях. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.
  18. ^ а б Utans, U .; Liang, P .; Wyner, L.R .; Карновский, М. Дж .; Рассел, М. Э. (1994). «Хроническое сердечное отторжение: идентификация пяти активированных генов в трансплантированном сердце с помощью дифференциального отображения мРНК». Proc. Natl. Акад. Sci. Соединенные Штаты Америки. 91 (14): 6463–6467. Дои:10.1073 / pnas.91.14.6463. ЧВК  44222. PMID  8022806.
  19. ^ а б Taniguchi, M .; Миура, К .; Iwao, H .; Яманака, С. (2001). «Количественная оценка микрочипов ДНК - сравнение с нозерн-блоттингом». Геномика. 71 (1): 34–39. Дои:10.1006 / geno.2000.6427. PMID  11161795.
  20. ^ Крефт, К., Крефт, С., Комель, Р., Грубич, З. (2000). Нерадиоактивный нозерн-блоттинг для определения мРНК ацетилхолинэстеразы. Арка Пфлюгера - Eur J Physiol, 439: R66-R67

внешняя ссылка

Библиотечные ресурсы о
Нозерн-блот