Массивное параллельное секвенирование - Massive parallel sequencing

Массивное параллельное секвенирование или массово-параллельное секвенирование любой из нескольких высокопроизводительных подходов к Секвенирование ДНК использование концепции массово-параллельной обработки; это также называется секвенирование следующего поколения (NGS) или секвенирование второго поколения. Некоторые из этих технологий появились в 1994-1998 гг. [1][2][3][4][5] и были коммерчески доступны с 2005 года. В этих технологиях используются миниатюрные и распараллеленные платформы для секвенирования от 1 миллиона до 43 миллиардов коротких считываний (50-400 оснований каждое) на цикл прибора.

Многие платформы NGS отличаются инженерными конфигурациями и химией секвенирования. Они разделяют техническую парадигму массивного параллельного секвенирования с помощью пространственно разделенных, клонально усиленных ДНК матрицы или отдельные молекулы ДНК в проточная ячейка. Этот дизайн сильно отличается от дизайна Секвенирование по Сэнгеру - также известное как капиллярное секвенирование или секвенирование первого поколения - которое основано на электрофоретический разделение продуктов обрыва цепи, полученных в отдельных реакциях секвенирования.[6]

Платформы NGS

Секвенирование ДНК с помощью коммерчески доступных платформ NGS обычно проводится в следующие этапы. Во-первых, библиотеки секвенирования ДНК создаются путем клональной амплификации с помощью ПЦР in vitro. Во-вторых, ДНК секвенируется синтез, так что последовательность ДНК определяется добавлением нуклеотиды к комплементарной цепи, а не через химию обрыва цепи. В-третьих, пространственно сегрегированные, амплифицированные шаблоны ДНК секвенируются одновременно в массивно-параллельной манере без необходимости физического разделения. Хотя эти шаги выполняются на большинстве платформ NGS, каждая использует свою стратегию.[7]

NGS-распараллеливание реакций секвенирования генерирует считывания нуклеотидной последовательности от сотен мегабаз до гигабаз за один прогон прибора. Это позволило резко увеличить количество доступных данных о последовательностях и коренным образом изменило подходы к секвенированию генома в биомедицинских науках.[8]Новые технологии и инструменты NGS в дальнейшем способствовали значительному снижению стоимости секвенирования, приближающемуся к отметке в 1000 долларов за штуку. секвенирование генома.[9][10]

По состоянию на 2014 год коммерчески доступные платформы массового параллельного секвенирования, и их характеристики приведены в таблице. Поскольку технологии NGS быстро развиваются, технические характеристики и цены постоянно меняются.

An Иллюмина Секвенсор HiSeq 2000
Платформы NGS
ПлатформаПодготовка шаблонаХимияМаксимальная длина чтения (базы)Время выполнения (дни)Макс.Гб на запуск
Рош 454Клонально-emPCRПиросеквенирование400‡0.420.40-0.60
GS FLX ТитанКлонально-emPCRПиросеквенирование400‡0.420.035
Illumina MiSeqКлональное усиление мостаОбратимый терминатор с красителем2x3000.17-2.715
Illumina HiSeqКлональное усиление мостаОбратимый терминатор с красителем2x1500.3-11[11]1000[12]
Анализатор генома Illumina IIXКлональное усиление мостаОбратимый терминатор с красителем[13][14]2x1502-1495
Life Technologies SOLiD4Клонально-emPCRОлигонуклеотидное 8-мерное цепное лигирование[15]20-454-735-50
Life Technologies Ион Протон[16]Клонально-emPCRНативные дНТФ, обнаружение протонов2000.5100
Полная геномикаДНК-наношарики с сеткойОлигонуклеотидное 9-мерное свободное лигирование[17][18][19]7x10113000
Helicos Biosciences HeliscopeОдиночная молекулаОбратимый терминатор с красителем35‡825
Тихоокеанские биологические науки SMRTОдиночная молекулаФосфосвязанные флуоресцентные нуклеотиды10,000 (N50 ); 30 000+ (макс.)[20]0.080.5[21]


Отмечаются время выполнения и выход в гигабазах (Гб) за цикл для одностороннего секвенирования. Время работы и выходы примерно удваиваются при выполнении секвенирования с парным концом. ‡ Средняя длина чтения для платформ Roche 454 и Helicos Biosciences.[22]

Методы подготовки шаблонов для NGS

При подготовке матриц для реакций NGS используются два метода: амплифицированные шаблоны, происходящие из отдельных молекул ДНК, и шаблоны отдельных молекул ДНК. Для систем визуализации, которые не могут обнаруживать отдельные события флуоресценции, требуется амплификация шаблонов ДНК. Три наиболее распространенных метода амплификации - это эмульсионная ПЦР (emPCR), катящийся круг и твердофазная амплификация. Окончательное распределение шаблонов может быть произвольным в пространстве или по сетке.

Эмульсионная ПЦР

В эмульсия ПЦР методы, Библиотека ДНК сначала создается путем случайной фрагментации геномной ДНК. Фрагменты одноцепочечной ДНК (матрицы) прикрепляются к поверхности бусинок с помощью адаптеров или линкеров, а одна бусина присоединяется к единственному фрагменту ДНК из библиотеки ДНК. Поверхность бусинок содержит олигонуклеотид зонды с последовательностями, комплементарными адаптерам, связывающим фрагменты ДНК. Затем гранулы разделяются на капли водно-масляной эмульсии. В водно-масляной эмульсии каждая капля, захватывающая одну гранулу, представляет собой ПЦР. микрореактор который производит амплифицированные копии единой матрицы ДНК.[23][24][25]

Сетчатые наношарики с катящимся кругом

Амплификация популяции одиночных молекул ДНК путем усиление катящегося круга в растворе следует захват на сетке пятен, размер которых меньше размера ДНК, подлежащей иммобилизации.[26][27][28][29]

Генерация колоний ДНК (Мостиковая амплификация)

Прямой и обратный праймеры ковалентно прикреплены к слайду в проточной ячейке с высокой плотностью. Отношение праймеров к матрице на носителе определяет поверхностную плотность амплифицированных кластеров. Проточная ячейка подвергается воздействию реагентов для полимераза -основное удлинение, и праймирование происходит, когда свободный / дистальный конец лигированного фрагмента «соединяется» с комплементарным олиго на поверхности. Повторяется денатурация а удлинение приводит к локальной амплификации фрагментов ДНК в миллионах отдельных мест на поверхности проточной кюветы. Твердофазная амплификация дает 100–200 миллионов пространственно разделенных кластеров матрицы, обеспечивая свободные концы, к которым затем гибридизируется универсальный праймер для секвенирования, чтобы инициировать реакцию секвенирования.[23][24] Эта технология была подана на патент в 1997 году Женевским институтом биомедицинских исследований Glaxo-Welcome (GBRI) Паскалем Майером, Эриком Кавашима и Лораном Фаринелли,[3][4] и впервые была публично представлена ​​в 1998 году.[5] В 1994 г. Крис Адамс и Стив Крон подали патент на аналогичный, но неклональный, метод поверхностной амплификации, названный «мостиковая амплификация».[2] адаптировано для клональной амплификации в 1997 г. Чёрчем и Митрой.[26][27]

Одномолекулярные шаблоны

Протоколы, требующие амплификации ДНК, часто трудны для реализации и могут приводить к ошибкам при секвенировании. Подготовка шаблонов из одной молекулы более проста и не требует ПЦР, которая может привести к ошибкам в амплифицированных шаблонах. Последовательности-мишени, богатые AT и GC, часто демонстрируют систематическую ошибку амплификации, что приводит к их недопредставленности при выравнивании и сборках геномов. Матрицы одиночных молекул обычно иммобилизуют на твердых носителях с использованием одного из по крайней мере трех различных подходов. В первом подходе пространственно распределенные отдельные молекулы праймера ковалентно прикрепляются к твердой подложке. Шаблон, который получают путем случайного фрагментирования исходного материала на небольшие размеры (например, ~ 200–250 п.н.) и добавления общих адаптеров к концам фрагментов, затем гибридизуют с иммобилизованным праймером. Во втором подходе пространственно распределенные матрицы из одной молекулы ковалентно прикрепляются к твердой подложке путем праймирования и удлинения одноцепочечных матриц из одной молекулы из иммобилизованных праймеров. Затем с матрицей гибридизируется общий праймер. В любом подходе ДНК-полимераза может связываться с иммобилизованной конфигурацией примированной матрицы, чтобы инициировать реакцию NGS. Оба вышеупомянутых подхода используются Helicos BioSciences. В третьем подходе пространственно распределенные одиночные молекулы полимеразы прикрепляются к твердой подложке, с которой связана праймированная молекула-матрица. Этот подход используется Pacific Biosciences. С этим методом можно использовать более крупные молекулы ДНК (до десятков тысяч пар оснований), и, в отличие от первых двух подходов, третий подход может использоваться с методами в реальном времени, что приводит к потенциально большей длине считывания.

Подходы к секвенированию

Пиросеквенирование

В 1996 г. Пол Нюрен и его ученик Мостафа Ронаги в Королевском технологическом институте в Стокгольм опубликовали свой метод пиросеквенирование.[1] Пиросеквенирование - это неэлектрофоретический метод биолюминесценции, который измеряет высвобождение неорганических пирофосфат путем пропорционального преобразования его в видимый свет с помощью ряда ферментативных реакций. В отличие от других подходов к секвенированию, которые используют модифицированные нуклеотиды для прекращения синтеза ДНК, метод пиросеквенирования манипулирует ДНК-полимеразой путем однократного добавления dNTP в ограниченных количествах. При включении комплементарного dNTP ДНК-полимераза удлиняет праймер и приостанавливает действие. Синтез ДНК возобновляется после добавления следующего комплементарного dNTP в цикле распределения. Порядок и интенсивность световых пиков записываются в виде диаграмм, которые показывают лежащую в основе последовательность ДНК.[30]

Секвенирование по химии обратимого терминатора

В этом подходе используются dNTP, связанные с обратимым терминатором, в циклическом методе, который включает включение нуклеотидов, флуоресцентную визуализацию и расщепление. Флуоресцентно меченый терминатор визуализируется при добавлении каждого dNTP, а затем отщеплении, чтобы обеспечить включение следующего основания. Эти нуклеотиды химически блокируются. так что каждое объединение - уникальное событие. За каждым этапом включения оснований следует этап визуализации, затем блокированная группа химически удаляется, чтобы подготовить каждую цепь для следующего включения ДНК-полимеразой. Эта серия шагов продолжается в течение определенного количества циклов, определяемого пользовательскими настройками прибора. 3'-блокирующие группы изначально задумывались как ферментативные[31] или химическое обращение[13][14] Химический метод лег в основу аппаратов Solexa и Illumina. Секвенирование с помощью химии обратимых терминаторов может быть четырехцветным циклом, используемым Illumina / Solexa, или одноцветным циклом, используемым Helicos BioSciences. «Виртуальные терминаторы», которые представляют собой разблокированные терминаторы со вторым аналогом нуклеозида, который действует как ингибитор. Эти терминаторы имеют соответствующие модификации для терминирующих или ингибирующих групп, так что синтез ДНК прекращается после добавления одного основания.[24][32][33]

Последовательность лигирования, опосредованная ферментами лигазы

В этом подходе реакция удлинения последовательности осуществляется не полимеразами, а ДНК. лигаза и зонды с кодировкой одного основания или зонды с кодированием двух оснований. В своей простейшей форме флуоресцентно меченый зонд гибридизуется со своей комплементарной последовательностью, соседней с примированной матрицей. Затем добавляется ДНК-лигаза, чтобы присоединить меченый красителем зонд к праймеру. Нелигированные зонды смывают, а затем флуоресцентная визуализация для определения идентичности лигированного зонда. Цикл может быть повторен либо с использованием расщепляемых зондов для удаления флуоресцентного красителя и регенерации группы 5'-PO4 для последующих циклов лигирования (цепное лигирование[15][34]) или путем удаления и гибридизации нового праймера с матрицей (несвязанное лигирование[17][18]).

Фосфосвязанные флуоресцентные нуклеотиды или секвенирование в реальном времени

Тихоокеанские биологические науки в настоящее время является лидером этого метода. Метод секвенирования в реальном времени включает отображение непрерывного включения меченных красителем нуклеотидов во время синтеза ДНК: отдельные молекулы ДНК-полимеразы прикрепляются к нижней поверхности отдельных волноводных детекторов нулевого режима (детекторов Zmw), которые могут получить информацию о последовательности, пока фосфосвязанный нуклеотиды включаются в растущую цепь праймера. Pacific Biosciences использует уникальную ДНК-полимеразу, которая лучше включает фосфо-связанные нуклеотиды и позволяет повторно секвенировать замкнутые кольцевые матрицы. Хотя точность однократного считывания составляет 87%, согласованная точность была продемонстрирована на уровне 99,999% с несколькими -kilobase читать длины.[35][36] В 2015 году Pacific Biosciences выпустила новый инструмент для секвенирования под названием Sequel System, который увеличивает производительность примерно в 6,5 раз.[37][38]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б М. Ронаги; С. Карамохамед; Б. Петтерссон; М. Улен и П. Найрен (1996). «Секвенирование ДНК в реальном времени с использованием обнаружения высвобождения пирофосфата». Аналитическая биохимия. 242 (1): 84–9. Дои:10.1006 / abio.1996.0432. PMID  8923969.
  2. ^ а б Патент США 5641658 Метод выполнения амплификации нуклеиновой кислоты с двумя праймерами, связанными с одной твердой подложкой. Изобретатели: Кристофер П. Адамс, Стивен Джозеф Крон
  3. ^ а б заявка WO1998044151A1, Лоран Фаринелли, Эрик Кавашима, Паскаль Майер, "Метод амплификации нуклеиновых кислот", опубликовано 8 октября 1998 г. 
  4. ^ а б заявка WO1998044152A1, Лоран Фаринелли, Эрик Кавашима, Паскаль Майер, "Метод секвенирования нуклеиновых кислот", опубликовано 8 октября 1998 г. 
  5. ^ а б П. Майер и др., Представленные на Пятой Международной конференции по автоматизации в картировании и секвенировании ДНК, Сент-Луис, Миссури, США (7–10 октября 1998 г.). Массово-параллельное секвенирование колоний ДНК Презентация ams98 «Очень крупномасштабный, высокопроизводительный и недорогой метод секвенирования ДНК, основанный на новом двухмерном процессе авто-паттерна ДНК» Проверять | url = ценить (Помогите).CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  6. ^ Карл В. Фелькердинг; Шале А. Дэймс и Джейкоб Д. Дурчи (2009). «Секвенирование следующего поколения: от фундаментальных исследований до диагностики». Клиническая химия. 55 (4): 641–658. Дои:10.1373 / Clinchem.2008.112789. PMID  19246620.
  7. ^ Мэтью В. Андерсон; Ирис Шрайвер (2010). «Секвенирование ДНК следующего поколения и будущее геномной медицины». Гены. 1 (1): 38–69. Дои:10.3390 / genes1010038. ЧВК  3960862. PMID  24710010.
  8. ^ Трейси Такер; Марко Марра и Ян М. Фридман (август 2009 г.). «Массовое параллельное построение последовательности - следующий большой шаг в генетической медицине». Am J Hum Genet. 85 (2): 142–54. Дои:10.1016 / j.ajhg.2009.06.022. ЧВК  2725244. PMID  19679224.
  9. ^ Андреас фон Бубнофф (2008). «Секвенирование следующего поколения: гонка началась». Ячейка. 132 (5): 721–723. Дои:10.1016 / j.cell.2008.02.028. PMID  18329356.
  10. ^ «Выпуск 2008 г .: NHGRI ищет технологии секвенирования ДНК, пригодные для повседневного лабораторного и медицинского использования». Genome.gov. Получено 2012-08-05.
  11. ^ «Архивная копия». Архивировано из оригинал на 2014-12-06. Получено 2014-11-06.CS1 maint: заархивированная копия как заголовок (связь)
  12. ^ «Архивная копия». Архивировано из оригинал на 2014-11-06. Получено 2014-11-06.CS1 maint: заархивированная копия как заголовок (связь)
  13. ^ а б патент US7790869B2, Цзинюэ Цзюй, Цзэнминь Ли, Джон Роберт Эдвардс, Ясухиро Итагаки, «Массивный параллельный метод декодирования ДНК и РНК», опубликовано 07 сентября 2010 г. 
  14. ^ а б Bentley DR и др. (6 ноября 2008 г.). «Точное секвенирование всего человеческого генома с использованием химии обратимых терминаторов». Природа. 456 (7218): 53–9. Bibcode:2008Натура 456 ... 53Б. Дои:10.1038 / природа07517. ЧВК  2581791. PMID  18987734.
  15. ^ а б МакКернан К.Дж. и др. (Сентябрь 2009 г.). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, выявленные короткочитаемым, массивно параллельным секвенированием лигирования с использованием двухосновного кодирования». Genome Res. 19 (9): 1527–41. Дои:10.1101 / гр.091868.109. ЧВК  2752135. PMID  19546169.
  16. ^ "Ион Торрент". Архивировано из оригинал 30 декабря 2013 г.. Получено 1 января 2014.
  17. ^ а б Drmanac R, et al. (2010). «Секвенирование генома человека с использованием несвязанного основания читает о самособирающихся нанометрах ДНК». Наука. 327 (5961): 78–81. Bibcode:2010Sci ... 327 ... 78D. Дои:10.1126 / science.1181498. PMID  19892942.
  18. ^ а б Шендуре Дж., Поррека Дж. Дж., Реппас Н. Б., Лин Х, МакКатчеон Дж. П., Розенбаум А. М., Ван М. Д., Чжан К., Митра Р. Д., Чёрч Г. М. (2005). «Точное мультиплексное секвенирование полонии эволюционировавшего бактериального генома». Наука. 309 (5741): 1728–32. Bibcode:2005Sci ... 309.1728S. Дои:10.1126 / science.1117389. PMID  16081699.
  19. ^ Peters BA, et al. (2012). «Точное секвенирование всего генома и гаплотипирование от 10-20 клеток человека». Природа. 487 (7406): 190–195. Bibcode:2012Натура.487..190P. Дои:10.1038 / природа11236. ЧВК  3397394. PMID  22785314.
  20. ^ Pacific Biosciences представляет новую химию с увеличенными длинами считывания для обнаружения новых особенностей в последовательности ДНК и продвинутых исследований генома крупных организмов
  21. ^ Лекс Недербрагт (05.07.2013). "Сборка бактериального генома de novo: проблема решенная?".
  22. ^ Карл В. Фелькердинг; Shale Dames и Джейкоб Д. Дурчи (сентябрь 2010 г.). «Диагностическое секвенирование следующего поколения». J Molec Diagn. 12 (5): 539–51. Дои:10.2353 / jmoldx.2010.100043. ЧВК  2928417. PMID  20805560.
  23. ^ а б Чи-Сенг, Ку; Эн Юн, Лой; Юди, Павитан; и Ки-Сенг, Чиа. Технологии секвенирования нового поколения и их приложения. В: Энциклопедия наук о жизни (ELS). John Wiley & Sons, Ltd: Чичестер, апрель 2010 г.
  24. ^ а б c Metzker ML (январь 2010 г.). «Технологии секвенирования - новое поколение». Нат Рев Жене. 11 (1): 31–46. Дои:10.1038 / nrg2626. PMID  19997069.
  25. ^ Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B (22 июля 2003 г.). «Преобразование отдельных молекул ДНК в флуоресцентные магнитные частицы для обнаружения и подсчета генетических вариаций». Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15): 8817–22. Bibcode:2003ПНАС..100.8817Д. Дои:10.1073 / pnas.1133470100. ЧВК  166396. PMID  12857956.
  26. ^ а б патент US6485944B1, Джордж М. Черч, Роб Митра, "Реплика амплификации массивов нуклеиновых кислот", опубликовано 26 ноября 2002 г. 
  27. ^ а б Mitra R, Church GM (декабрь 1999 г.). «Локализованная амплификация in situ и контактная репликация многих отдельных молекул ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 27 (24): e34, 1–6. Дои:10.1093 / nar / 27.24.e34. ЧВК  148757. PMID  10572186.
  28. ^ заявка WO2007120208A3, Джордж М. Черч, Грегори Дж. Поррека, Авраам Розенбаум, Джей Шендуре, «Секвенирование ДНК с вращающимся кругом с помощью наношетки», опубликовано 28 августа 2008 г. 
  29. ^ патент US8445194B2, Радое Дрманак, Мэтью Дж. Каллоу, Снежана Дрманак, Брайан К. Хаузер, Джордж Йунг, «Массивы одиночных молекул для генетического и химического анализа», опубликовано 21 мая 2013 г. 
  30. ^ Высокопроизводительное секвенирование ДНК - концепции и ограничения, Мартин Кирчер и Джанет Келсо, Bioessays 32: 524–536, 2010 WILEY Periodicals Inc.
  31. ^ заявка WO2001023610A2, Шанкар Баласубраманян, "Полинуклеотидное секвенирование", опубликовано 05 апреля 2001 г. 
  32. ^ «Пробирная технология». Illumina. Архивировано из оригинал на 2012-08-26. Получено 2012-08-05.
  33. ^ «Настоящее секвенирование одной молекулы (tSMS ™): Helicos BioSciences». Helicosbio.com. Архивировано из оригинал на 2012-03-11. Получено 2012-08-05.
  34. ^ «Основы 2-х базового кодирования и цветового пространства». Appliedbiosystems.cnpg.com. Получено 2012-08-05.
  35. ^ Чин С.С., Александр Д.Х., Маркс П., Кламмер А.А., Дрейк Дж., Хайнер С., Клам А., Коупленд А., Хаддлстон Дж., Эйхлер Е.Э., Тернер С.В., Корлах Дж. (Июнь 2013 г.). «Негибридные, готовые сборки микробного генома на основе данных секвенирования SMRT». Нат методы. 10 (6): 563–9. Дои:10.1038 / nmeth.2474. PMID  23644548.
  36. ^ Моника Хегер (5 марта 2013 г.). «Пользователи PacBio сообщают о прогрессе в долгих чтениях сборки генома растений, сложных областях генома человека».
  37. ^ «PacBio запускает высокопроизводительную и недорогую систему секвенирования одиночных молекул».
  38. ^ http://www.bio-itworld.com/2015/9/30/pacbio-announces-sequel-sequencing-system.aspx