Лигирование (молекулярная биология) - Ligation (molecular biology)

Эта статья о лигировании нуклеиновых кислот. О лигировании пептидов см. Химическая перевязка. Для использования в других целях см. Лигирование (значения).
А липкий конец перевязка

В молекулярная биология, перевязка представляет собой соединение двух фрагментов нуклеиновой кислоты под действием фермента. Это важная лабораторная процедура в молекулярное клонирование ДНК, посредством чего фрагменты ДНК соединяются вместе для создания рекомбинантная ДНК молекулы, например, когда фрагмент чужеродной ДНК вставлен в плазмида. Концы фрагментов ДНК соединяются вместе путем образования фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксилом одного конца ДНК с 5'-фосфорилом другого. РНК также может быть лигирована аналогичным образом. В реакции обычно участвует кофактор, обычно это АТФ или НАД.+.

Лигирование в лаборатории обычно выполняется с использованием Т4 ДНК-лигаза Однако также популярны процедуры лигирования без использования стандартной ДНК-лигазы.

Перевязочная реакция

Механизм реакции лигирования был впервые выяснен в лаборатории Роберта Лемана.[1][2] Два фрагмента ДНК могут быть соединены вместе ДНК-лигаза который катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3'-ОН на одном конце цепи ДНК и 5'-фосфатной группой другого. У животных и бактериофаг, АТФ используется в качестве источника энергии для перевязки, а у бактерий НАД+ используется.[3]

ДНК-лигаза сначала реагирует с АТФ или НАД.+, образуя промежуточный продукт лигаза-AMP с AMP связаны с ε-аминогруппой лизина в активном центре лигазы через фосфоамидную связь. Этот аденилил Затем группа переносится на фосфатную группу на 5'-конце цепи ДНК, образуя комплекс ДНК-аденилат. Наконец, фосфодиэфирная связь между двумя концами ДНК образуется в результате нуклеофильной атаки 3'-гидроксила на конце цепи ДНК на активированную 5'-фосфорильную группу другого.[1]

А ник в ДНК (то есть разрыв одной цепи двухцепочечной ДНК) может быть очень эффективно восстановлен лигазой. Однако при лигировании двух отдельных концов ДНК возникает усложняющая особенность лигирования, поскольку эти два конца должны соединиться, прежде чем реакция лигирования может продолжиться. При лигировании ДНК с липкие или липкие концы, выступающие нити ДНК могут быть уже отожжены вместе, поэтому это относительно эффективный процесс, поскольку он эквивалентен восстановлению двух разрывов в ДНК. Однако при перевязке тупые концы, у которых отсутствуют выступающие концы для ДНК для отжига вместе, процесс зависит от случайного столкновения концов, чтобы они выровнялись вместе, прежде чем они могут быть лигированы, и, следовательно, является гораздо менее эффективным процессом.[4] ДНК-лигаза из Кишечная палочка не может лигировать ДНК с тупыми концами, кроме как в условиях молекулярного скопления, и поэтому обычно не используется для лигирования в лаборатории. Вместо этого ДНК-лигаза из фаг Т4 используется, поскольку он может лигировать ДНК с тупыми концами, а также одноцепочечную ДНК.[5][3]

Факторы, влияющие на перевязку

Факторы, которые влияют на ферментно-опосредованную химическую реакцию, будут естественно влиять на реакцию лигирования, например, на концентрацию фермента и реагентов, а также на температуру реакции и продолжительность инкубации. Лигирование осложняется тем фактом, что желаемые продукты лигирования для большинства реакций лигирования должны находиться между двумя разными молекулами ДНК, и реакция включает как меж-, так и внутримолекулярные реакции, и что для эффективного лигирования необходима дополнительная стадия отжига.

Три шага для образования новой фосфодиэфирной связи во время лигирования: аденилилирование фермента, перенос аденилила на ДНК и запечатывание разрывов. Mg (2+) является кофактором для катализа, поэтому при высокой концентрации Mg (2+) эффективность лигирования высока. Если концентрация Mg (2+) ограничена, заделка трещин является лимитирующей реакцией процесса, и промежуточный аденилилированный ДНК остается в растворе. Такое аденилилирование фермента сдерживает повторное связывание с аденилилированной промежуточной ДНК, сравниваемой ахиллесовой пятой LIG1, и представляет риск, если они не фиксируются.[6]

Концентрация ДНК

Концентрация ДНК может влиять на скорость лигирования и на то, является ли лигирование межмолекулярной или внутримолекулярной реакцией. Лигирование включает соединение концов ДНК с другими концами, однако каждый фрагмент ДНК имеет два конца, и если концы совместимы, молекула ДНК может образовывать кольцевую форму, соединив свои собственные концы. При высокой концентрации ДНК существует большая вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с концом другой ДНК, тем самым образуя межмолекулярное лигирование. При более низкой концентрации ДНК вероятность того, что один конец молекулы ДНК встретится с другим концом той же молекулы, увеличивается, поэтому внутримолекулярная реакция что делает ДНК более вероятной. В эффективность трансформации линейной ДНК также намного ниже, чем кольцевой ДНК, и для циркуляризации ДНК концентрация ДНК не должна быть слишком высокой. Как правило, общая концентрация ДНК должна быть менее 10 мкг / мл.[7]

Относительная концентрация фрагментов ДНК, их длина, а также буферные условия также являются факторами, которые могут влиять на то, будут ли предпочтительны межмолекулярные или внутримолекулярные реакции.

Концентрация ДНК может быть искусственно увеличена путем добавления конденсирующих агентов, таких как гексамин кобальта и биогенный полиамины Такие как спермидин, или используя агенты скопления Такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), которые также увеличивают эффективную концентрацию ферментов.[8][9] Однако обратите внимание, что такие добавки, как гексамин кобальта, могут вызывать исключительно межмолекулярную реакцию,[10] в результате линейный конкатемеры а не кольцевая ДНК, более подходящая для трансформация плазмидной ДНК и поэтому нежелательно для лигирования плазмиды. Если необходимо использовать добавки при лигировании плазмиды, использование ПЭГ является предпочтительным, поскольку он может способствовать как внутримолекулярному, так и межмолекулярному лигированию.[11]

Концентрация лигазы

Чем выше концентрация лигазы, тем быстрее скорость лигирования. Лигирование тупых концов намного менее эффективно, чем лигирование липких концов, поэтому при лигировании тупых концов используется более высокая концентрация лигазы. Высокая концентрация ДНК-лигазы может использоваться в сочетании с ПЭГ для более быстрого лигирования, и они являются компонентами, которые часто встречаются в коммерческих наборах, разработанных для быстрого лигирования.[12][13]

Температура

При рассмотрении температуры реакции лигирования возникают два вопроса. Во-первых, оптимальная температура для активности ДНК-лигазы - 37°C, а во-вторых, температура плавления (Тм) концов ДНК, подлежащих лигированию. Температура плавления зависит от длины и состава основания выступа ДНК - чем больше число G и C, тем выше Tм поскольку существует три водородных связи, образованных между парой оснований G-C, по сравнению с двумя для пары оснований A-T - с некоторым вкладом от наложения оснований между фрагментами. Чтобы реакция лигирования протекала эффективно, концы должны быть стабильно отожжены, и в экспериментах по лигированию Tм концов ДНК обычно намного ниже 37°Таким образом, оптимальная температура для лигирования липких концов - это компромисс между наилучшей температурой для активности ДНК-лигазы и Tм где концы могут соединяться.[14] Однако разные рестрикционные ферменты генерируют разные концы, и основной состав концов, производимых этими ферментами, также может отличаться, температура плавления и, следовательно, оптимальная температура может широко варьироваться в зависимости от используемых рестрикционных ферментов, а оптимальная температура для лигирования может быть между 4-15°C в зависимости от концов.[15][16] Лигирование также часто включает лигирование концов, образованных разными рестрикционными ферментами в одной и той же реакционной смеси, поэтому выбор оптимальной температуры для конкретной реакции лигирования может оказаться непрактичным, и большинство протоколов просто выбирают 12-16°C, комнатная температура или 4°С.

Состав буфера

В ионная сила используемого буфера может повлиять на лигирование. Типы присутствия катионов также могут влиять на реакцию лигирования, например, избыточное количество Na+ может сделать ДНК более жесткой и увеличить вероятность межмолекулярного лигирования. При высокой концентрации одновалентного катиона (> 200 мМ) лигирование также может быть почти полностью подавлено.[17] Стандартный буфер, используемый для лигирования, разработан для минимизации ионных эффектов.[18]

Перевязка липких концов

Рестрикционные ферменты могут генерировать самые разные концы в ДНК, которую они переваривают, но в экспериментах по клонированию наиболее часто используемые рестрикционные ферменты генерируют одноцепочечный выступ из 4 оснований, называемый липким или когезионным концом (исключения включают Ндея которые образуют выступ с двумя основаниями, и те, которые создают тупые концы). Эти липкие концы могут отжигаться с другими совместимыми концами и лигироваться в результате лигирования липких концов (или когезионных концов). ЭкоRI например, образует конец AATT, и поскольку A и T имеют более низкую температуру плавления, чем C и G, его температура плавления Tм низкий - около 6°С.[19] Для большинства рестрикционных ферментов образующиеся выступы имеют Tм это около 15°С.[18] В практических целях перевязка липких концов выполняется в 12-16 лет.°C, или при комнатной температуре, или, альтернативно, при 4°C на более длительный период.

Для вставки фрагмента ДНК в плазмидный вектор предпочтительно использовать два разных рестрикционных фермента для расщепления ДНК, чтобы образовались разные концы. Два разных конца могут предотвратить повторное соединение вектора без какой-либо вставки, а также позволяют вставлять фрагмент направленным образом.

Когда невозможно использовать два разных сайта, может потребоваться дефосфорилирование векторной ДНК, чтобы избежать высокого фона рециркуляризованной векторной ДНК без вставки. Без фосфатной группы на концах вектор не может лигироваться сам с собой, но может быть лигирован со вставкой с фосфатной группой. Дефосфорилирование обычно проводится с использованием щелочная фосфатаза из кишечника теленка (CIAP), который удаляет фосфатную группу с 5'-конца расщепленной ДНК, но обратите внимание, что CIAP нелегко инактивировать и может мешать лигированию без дополнительной стадии по удалению CIAP, что приводит к невозможности лигирования. CIAP не следует использовать в чрезмерных количествах, и его следует использовать только при необходимости. Креветка щелочная фосфатаза (SAP) или антарктическая фосфатаза (AP) являются подходящей альтернативой, поскольку их можно легко инактивировать.

Перевязка тупого конца

Лигирование тупых концов не включает спаривание оснований выступающих концов, поэтому любой тупой конец можно лигировать с другим тупым концом. Тупые концы могут быть образованы рестрикционными ферментами, такими как Smaя и ЭкоRV. Основным преимуществом клонирования тупых концов является то, что желаемая вставка не требует каких-либо сайтов рестрикции в ее последовательности, поскольку тупые концы обычно образуются в ПЦР, а ПЦР сгенерированный фрагмент ДНК с тупыми концами затем можно лигировать в вектор с тупыми концами, полученный из рестрикционного гидролизата.

Тупой конец лигирование, однако, намного менее эффективно, чем лигирование липких концов, обычно реакция в 100 раз медленнее, чем лигирование липких концов. Поскольку тупой конец не имеет выступающих концов, реакция лигирования зависит от случайных столкновений между тупыми концами и, следовательно, намного менее эффективна. Чтобы компенсировать более низкую эффективность, концентрация используемой лигазы выше, чем при лигировании липких концов (в 10 раз или больше). Концентрация ДНК, используемая при лигировании тупых концов, также выше, чтобы увеличить вероятность столкновения между концами, и более длительное время инкубации также может использоваться для лигирования тупых концов.

Если оба конца, которые необходимо лигировать в вектор, имеют тупой конец, то вектор необходимо дефосфорилировать, чтобы минимизировать самолигирование. Это можно сделать с помощью CIAP, но, как отмечалось ранее, при его использовании необходимо соблюдать осторожность. Поскольку вектор был дефосфорилирован, а для лигирования требуется присутствие 5'-фосфата, вставка должна быть фосфорилирована. В продукте ПЦР с тупым концом обычно отсутствует 5'-фосфат, поэтому его необходимо фосфорилировать обработкой Полинуклеотидкиназа Т4.[20]

Лигирование тупых концов также обратимо ингибируется высокой концентрацией АТФ.[21]

ПЦР обычно генерирует продукты ПЦР с тупым концом, но учтите, что ПЦР с использованием Taq полимераза может добавить дополнительный аденин (A) к 3'-концу продукта ПЦР. Это свойство может быть использовано в Клонирование ТА где концы продукта ПЦР могут отжигаться с концом T вектора. Лигирование ТА поэтому является формой перевязки липких концов. Векторы с тупыми концами можно превратить в вектор для лигирования ТА с дидезокситимидинтрифосфатом (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы.

Общие рекомендации

Для клонирования вставки в кольцевую плазмиду:

  • Используемая общая концентрация ДНК должна быть менее 10 мкг / мл, поскольку плазмиде необходимо рециркуляризоваться.
  • Молярное отношение вставки к вектору обычно составляет около 3: 1. При очень высоком соотношении можно получить несколько пластин. Соотношение может регулироваться в зависимости от размера вставки, и могут использоваться другие соотношения, например 1: 1.

Исправление проблем

Иногда лигирование не позволяет получить желаемые лигированные продукты, и некоторые из возможных причин могут быть:

  • Поврежденная ДНК - чрезмерное воздействие УФ-излучения во время подготовки ДНК к лигированию может повредить ДНК и значительно снизить эффективность трансформации. УФ-излучение с более высокой длиной волны (365 нм), которое вызывает меньшее повреждение ДНК, следует использовать, если это необходимо для работы с ДНК на УФ-трансиллюминаторе в течение длительного периода времени. Добавление цитидин или же гуанозин в буфер для электрофореза в концентрации 1 мМ, однако может защитить ДНК от повреждения.[22]
  • Неправильное использование CIAP или его неэффективная деактивация или удаление.
  • Использовано чрезмерное количество ДНК.
  • Неполный Дайджест ДНК - Неполностью переваренная векторная ДНК дает высокий фон, и это можно проверить, выполнив лигирование без вставки в качестве контроля. Вставка, которая не полностью переварена, также не будет правильно лигироваться и образовывать округлую форму. При переваривании продукта ПЦР убедитесь, что к 5'-концам олигонуклеотидов, используемых для ПЦР, было добавлено достаточное количество дополнительных оснований, поскольку многие рестрикционные ферменты требуют минимального количества дополнительных пар оснований для эффективного переваривания. Информацию о минимальной необходимой паре оснований можно получить у поставщиков рестрикционных ферментов, например, в каталоге Биолаборатории Новой Англии.[23]
  • Неполное лигирование - ДНК с тупыми концами (например, Smaя ) и некоторые липкие концы ДНК (например, Ндея ), которые имеют низкую температуру плавления, требуют большего количества лигазы и более длительного времени инкубации.[24]
  • Белок, экспрессируемый из вставки лигированного гена, токсичен для клеток.
  • Гомологичная последовательность во вставке к последовательности в плазмидной ДНК приводит к делеции.

Другие методы лигирования ДНК

В ряде имеющихся в продаже наборов для клонирования ДНК используются другие методы лигирования, которые не требуют использования обычных ДНК-лигаз. Эти методы позволяют клонировать гораздо быстрее, а также упрощают перенос вставки клонированной ДНК в разные векторов. Однако эти методы требуют использования специально разработанных векторов и компоненты, и может не иметь гибкости.

Лигирование, опосредованное топоизомеразой

Топоизомераза может использоваться вместо лигазы для лигирования, и клонирование может быть выполнено быстрее без необходимости рестрикционного переваривания вектора или вставки. В этом Клонирование ТОПО метод линеаризованный вектор активируется путем присоединения топоизомеразы I к его концам, и этот «TOPO-активированный» вектор может затем принимать продукт ПЦР путем лигирования к обоим 5'-концам продукта ПЦР, высвобождается топоизомераза и кольцевой вектор образуется в процессе.[25]

Гомологичная рекомбинация

Другой метод клонирования без использования лигазы - это Рекомбинация ДНК, например, как используется в Система клонирования шлюза.[26][27] Ген, однажды клонированный в клонирующий вектор (называемый в этом методе входным клоном), может быть удобно введен во множество экспрессионных векторов путем рекомбинации.[28]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б Николь Кресдж, Роберт Д. Симони и Роберт Л. Хилл (12 января 2007 г.). "Взгляд на объединение ДНК: I. Работа Роберта Лемана по ДНК-лигазе". Журнал биологической химии. 282.CS1 maint: использует параметр авторов (связь)
  2. ^ Модорич П., Lehman IR (10 ноября 1973 г.). «Лигаза дезоксирибонуклеиновой кислоты. Кинетический анализ стационарного состояния реакции, катализируемой ферментом из Escherichia coli» (PDF). J Biol Chem. 248 (21): 7502–11. PMID  4355585.
  3. ^ а б Люберт Страйер (2007). Биохимия (3-е изд.). Фримен. стр.658 –659.
  4. ^ Венеция А. Сондерс (6 декабря 2012 г.). Применение микробной генетики в биотехнологии :: принципы и методы передачи генов и манипуляции с ними. Springer. ISBN  9781461597964.
  5. ^ Роберт В. Олд; Сэнди Б. Примроуз (27 сентября 1994). Принцип манипуляции генами - введение в генную инженерию (5-е изд.). Blackwell Scientific. п.37. ISBN  9780632037124.
  6. ^ Тейлор, Конрад, Валь, О'Брайан (июль 2011 г.). «Кинетический механизм ДНК-лигазы I человека обнаруживает магний-зависимые изменения на этапе ограничения скорости, которые ставят под угрозу эффективность лигирования». Журнал биологической химии. 286 (26): 23054–23062. Дои:10.1074 / jbc.m111.248831. ЧВК  3123073. PMID  21561855 - через один поиск.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  7. ^ Джозеф Сэмбрук; Дэвид Рассел. «Глава 1: Плазмиды и их полезность в молекулярном клонировании». Молекулярное клонирование - лабораторное руководство. 1 (3-е изд.). С. 1.20–1.21. ISBN  978-0-87969-577-4.
  8. ^ JR Rusche; П. Ховард-Фландерс (25 марта 1985 г.). «Гексамин хлорид кобальта способствует межмолекулярному лигированию фрагментов ДНК с тупым концом ДНК-лигазой Т4». Исследования нуклеиновых кислот. 13 (6): 1997–2008. Дои:10.1093 / nar / 13.6.1997. ЧВК  341130. PMID  4000951.
  9. ^ Циммерман С.Б., Фейффер Б.Х. (1983). «Макромолекулярное скопление позволяет лигировать тупой конец ДНК-лигазами из печени крысы или Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 80 (19): 5852–6. Дои:10.1073 / pnas.80.19.5852. ЧВК  390173. PMID  6351067.
  10. ^ Джеймс Р. Руш; Пол Ховард-Фландерс (25 марта 1985 г.). «Хлорид гексамина кобальта способствует межмолекулярному лигированию фрагментов ДНК с тупым концом ДНК-лигазой Т4». Исследования нуклеиновых кислот. 13 (6): 1997–2008. Дои:10.1093 / nar / 13.6.1997. ЧВК  341130. PMID  4000951.
  11. ^ К. Хаяси; М. Накадзава; Y Ishizaki; Н. Хираока; Обаяси (10 октября 1986 г.). «Регулирование меж- и внутримолекулярного лигирования с ДНК-лигазой Т4 в присутствии полиэтиленгликоля». Исследования нуклеиновых кислот. 14 (19): 7617–7631. Дои:10.1093 / nar / 14.19.7617. ЧВК  311784. PMID  3022231.
  12. ^ "ЧАСТО ЗАДАВАЕМЫЕ ВОПРОСЫ". NEB.
  13. ^ «Набор для быстрой перевязки». NEB.
  14. ^ Роберт В. Олд; Сэнди Б. Примроуз (27 сентября 1994). Принцип манипуляции генами - введение в генную инженерию (5-е изд.). Blackwell Scientific. п.36. ISBN  9780632037124.
  15. ^ Л. Ферретти; V Sgaramella (10 января 1981 г.). «Температурная зависимость соединения ДНК-лигазой Т4 концов, продуцируемых эндонуклеазами рестрикции II типа». Исследования нуклеиновых кислот. 9 (1): 85–93. Дои:10.1093 / nar / 9.1.85. ЧВК  326670. PMID  6259621.
  16. ^ Дугайчик А., Бойер Х.В., Гудман Х.М. (25 июля 1975 г.). «Лигирование фрагментов ДНК, генерируемых эндонуклеазой EcoRI, в линейные и кольцевые структуры». Журнал молекулярной биологии. 96 (1): 171–84. Дои:10.1016/0022-2836(75)90189-8. PMID  169355.
  17. ^ Раае А.Дж., Клеппе Р.К., Клеппе К. (15 декабря 1975 г.). «Кинетика и действие солей и полиаминов на полинуклеотидлигазу Т4». Европейский журнал биохимии. 60 (2): 437–43. Дои:10.1111 / j.1432-1033.1975.tb21021.x. PMID  173544.
  18. ^ а б Г. Люкотт; Ф. Банейкс (1993). Введение в методы молекулярного клонирования. Вили-Блэквелл. п. 156. ISBN  978-0471188490.
  19. ^ Джанет Э. Мерц; Рональд В. Дэвис (1972). «Расщепление ДНК эндонуклеазой рестрикции R1 приводит к образованию когезионных концов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 69 (11): 3370–3374. Дои:10.1073 / pnas.69.11.3370. ЧВК  389773. PMID  4343968.
  20. ^ «Руководство по клонированию». New England Biolabs Inc.
  21. ^ Л. Ферретти; V Sgaramella (11 августа 1981 г.). «Специфическое и обратимое ингибирование активности присоединения тупых концов ДНК-лигазы Т4». Исследования нуклеиновых кислот. 9 (15): 3695–3705. Дои:10.1093 / nar / 9.15.3695. ЧВК  327385. PMID  6269089.
  22. ^ Грюндеманн Д., Шёмиг Э. (1996). «Защита ДНК во время препаративного электрофореза в агарозном геле от повреждений, вызванных ультрафиолетом» (PDF). Биотехнологии. 21 (5): 898–903. Дои:10.2144 / 96215rr02. PMID  8922632.
  23. ^ «Расщепление близко к концу фрагментов ДНК». New England Biolabs Inc.
  24. ^ Изменять.; Ge B .; Lee M .; Итак, М .; Ван В. (2005). «Исследование эффективности лигирования фрагментов, переваренных NdeI» (PDF). Журнал экспериментальной микробиологии и иммунологии. 7: 68–72. Получено 2012-10-29. (Обратите внимание, что в этой статье есть ошибка, описывающая НдеЯ как резчик с четырьмя базами.)
  25. ^ «Технология клонирования TOPO®». Invitrogen.
  26. ^ Эспозито Д., Гарви Л.А., Chakiath CS (2009). Клонирование шлюза для экспрессии белка. Методы молекулярной биологии. 498. стр.31–54. Дои:10.1007/978-1-59745-196-3_3. ISBN  978-1-58829-879-9. PMID  18988017.
  27. ^ «Методы клонирования - системы рекомбинационного клонирования». EMBL.
  28. ^ "Технология рекомбинационного клонирования Gateway®". Invitrogen.