Клонирование ТОПО - TOPO cloning

Клонирование ТОПО это молекулярная биология техника, в которой ДНК фрагменты клонированный в конкретные векторов без требования для ДНК-лигазы. Полимераза Taq имеет не зависящую от шаблона активность терминальной трансферазы, которая добавляет один дезоксиаденозин (A) к 3'-концу продуктов ПЦР. Эта характеристика используется при клонировании «липкого конца» TOPO TA.^[1] Для клонирования TOPO «тупым концом» реципиентный вектор не имеет выступов, и можно клонировать фрагменты ДНК с тупым концом.

Принцип

Этот метод использует присущую биологической активности ДНК-топоизомераза I. Биологическая роль топоизомеразы заключается в расщеплении и повторном соединении суперскрученный Концы ДНК для облегчения репликации. Вирус осповакцины топоизомераза I специфически распознает последовательность ДНК 5´- (C / T) CCTT-3 '. В течение репликация, фермент переваривает ДНК конкретно в этой последовательности, раскручивает ДНК и повторно лигирует ее по 3 'фосфатной группе тимидин основание.^[1]

Клонирование TOPO TA "липкий конец"

Векторы TOPO сконструированы таким образом, что они несут эту специфическую последовательность 5´- (C / T) CCTT-3 'на двух линейных концах. Линейная векторная ДНК уже имеет фермент топоизомеразу, ковалентно присоединенный к «свободным 3» концам обеих цепей. Затем его смешивают с продуктами ПЦР. Когда свободные 5'-концы цепей продукта ПЦР присоединяются к / 3'-концу топоизомеразы каждой цепи вектора, эти цепи ковалентно связываются уже связанной топоизомеразой. Эта реакция протекает эффективно, когда этот раствор инкубируют при комнатной температуре с необходимой солью. Для клонирования фрагментов, амплифицированных полимеразой Taq или Pfu, используются разные типы векторов, поскольку полимераза Taq (в отличие от Pfu) оставляет дополнительный нуклеотид «A» на 3'-конце во время амплификации.^[1]

Техника клонирования TA TOPO основана на способности аденина (A) и тимина (T) (комплементарные пары оснований) на различных фрагментах ДНК гибридизоваться и, в присутствии лигазы или топоизомеразы, лигироваться вместе. Вставка создается с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq, полимеразы, которая не имеет активности корректирующего считывания от 3 'до 5' и с высокой вероятностью добавляет один выступающий 3'-аденин на каждый конец продукта ПЦР. Лучше всего, если праймеры для ПЦР содержат гуанины на 5'-конце, поскольку это максимизирует вероятность того, что ДНК-полимераза Taq добавит концевой аденозиновый выступ. Не следует использовать термостабильные полимеразы, обладающие обширной экзонуклеазной активностью от 3´ до 5´, поскольку они не покидают выступающие 3´ адениновые выступы. Вектор-мишень линеаризуется и разрезается рестрикционным ферментом с тупым концом. Затем к этому вектору добавляется дидезокситимидинтрифосфат (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы. Важно использовать ddTTP, чтобы обеспечить добавление только одного остатка T. Этот хвост оставляет вектор с одним 3'-выступающим остатком тимина на каждом тупом конце.^[1]

Клонирование TOPO "тупым концом"

Полимеразы (такие как Phusion) или рестрикционные ферменты, которые образуют тупые концы, также могут быть использованы для клонирования TOPO. Вместо того, чтобы полагаться на липкие концы, вектор TOPO с тупым концом имеет тупые концы, на которых связаны молекулы топоизомеразы. Доступны коммерческие наборы, такие как Zero Blunt® Cloning Kit от Invitrogen.^[2]

Рекомендации

1. «Технология клонирования TOPO®». Технологии жизни. Получено 16 июля 2014.
2. «Наборы для клонирования Zero Blunt®». www.thermofisher.com.