Генотипирование SNP - SNP genotyping

SNP-генотипирование это измерение генетических вариаций однонуклеотидный полиморфизм (SNP) между членами вида. Это форма генотипирование, который является мерой более общей генетической изменчивости. SNP - один из наиболее распространенных типов генетической изменчивости. SNP - это мутация одной пары оснований в определенном локус, обычно состоящий из двух аллели (где частота редких аллелей составляет> 1%). Установлено, что SNP участвуют в этиология многих болезней человека и вызывают особый интерес в фармакогенетика. Поскольку SNP сохраняются в процессе эволюции, они были предложены в качестве маркеров для использования в локусах количественных признаков (QTL ) анализ и в ассоциативные исследования на месте микроспутники. Использование SNP расширяется в HapMap проект, целью которого является предоставление минимального набора SNP, необходимых для генотипирования генома человека. SNP также могут предоставить генетический отпечаток пальца для использования при проверке личности.[1] Повышение интереса к SNP отразилось в бурной разработке разнообразных методов генотипирования SNP.

Методы на основе гибридизации

Было разработано несколько приложений, которые опрашивают SNP путем гибридизации дополнительных ДНК-зондов с сайтом SNP. Задача этого подхода - снизить перекрестную гибридизацию между аллель-специфическими зондами. Эту проблему обычно преодолевают путем изменения условий жесткости гибридизации.[1]

Динамическая аллель-специфическая гибридизация

SNP-Dash-1updated.png

Генотипирование с динамической аллель-специфической гибридизацией (DASH) использует преимущества различий в температуре плавления ДНК, которые возникают в результате нестабильности несовпадающих пар оснований. Этот процесс можно в значительной степени автоматизировать и включает несколько простых принципов.

На первом этапе геномный сегмент амплифицируется и прикрепляется к бусинке через Реакция ПЦР с биотинилированной грунтовкой. На втором этапе усиленный продукт прикрепляется к стрептавидин колонку и промывали NaOH для удаления небиотинилированной цепи. An аллель-специфический олигонуклеотид затем добавляется в присутствии молекулы, которая флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК. Затем интенсивность измеряется по мере увеличения температуры до тех пор, пока температура плавления (Тм) можно определить. SNP приведет к более низкой, чем ожидалось, Tm.[2]

Поскольку генотипирование DASH измеряет количественно измеримое изменение Tm, оно способно измерять все типы мутаций, а не только SNP. Другие преимущества DASH включают возможность работы с датчиками без этикеток, а также простую конструкцию и рабочие условия.

Молекулярные маяки

SNP-Molecularprobe-1.png

Обнаружение SNP через молекулярные маяки использует специально сконструированный одноцепочечный олигонуклеотидный зонд. Олигонуклеотид сконструирован таким образом, что есть комплементарные области на каждом конце и последовательность зонда, расположенная между ними. Такая конструкция позволяет зонду принимать структуру шпильки или стержня-петли в естественном изолированном состоянии. К одному концу зонда прикреплен флуорофор, а к другому - гаситель флуоресценции. Из-за структуры зонда «стержень-петля» флуорофор находится в непосредственной близости от гасителя, что предотвращает излучение флуоресценции молекулой. Молекула также сконструирована таким образом, что только последовательность зонда комплементарна геномной ДНК, которая будет использоваться в анализе (Abravaya et al. 2003).

Если последовательность зонда молекулярного маяка встречает свою геномную ДНК-мишень во время анализа, она отжигается и гибридизируется. Из-за длины последовательности зонда шпилька зонда будет денатурирована в пользу образования более длинного и более стабильного гибрида зонд-мишень. Это конформационное изменение позволяет флуорофору и тушителю быть свободными от их тесной близости из-за ассоциации шпильки, позволяя молекуле флуоресцировать.

Если, с другой стороны, последовательность зонда встречает последовательность-мишень всего с одним некомплементарным нуклеотидом, молекулярный маяк будет предпочтительно оставаться в своем естественном состоянии шпильки, и флуоресценция не будет наблюдаться, поскольку флуорофор остается погашенным.

SNP-Molecularprobe-2.png

Уникальный дизайн этих молекулярных маяков позволяет с помощью простого диагностического анализа идентифицировать SNP в заданном месте. Если молекулярный маяк предназначен для сопоставления аллеля дикого типа, а другой - для сопоставления мутантного аллеля, эти два могут использоваться для идентификации генотипа человека. Если во время анализа определяется только длина волны флуорофора первого зонда, то индивид гомозиготен к дикому типу. Если определяется только длина волны второго зонда, то человек гомозиготен по мутантному аллелю. Наконец, если обе длины волны обнаружены, то оба молекулярных маяка должны гибридизоваться со своими комплементами, и, таким образом, индивидуум должен содержать оба аллеля и быть гетерозиготным.

Микроматрицы SNP

В массивы олигонуклеотидных SNP высокой плотности Сотни тысяч зондов размещены на небольшом чипе, что позволяет одновременно опрашивать множество SNP.[1] Поскольку аллели SNP различаются только одним нуклеотидом и поскольку трудно достичь оптимальных условий гибридизации для всех зондов в массиве, целевая ДНК может гибридизоваться с несовпадающими зондами. Отчасти это решается путем использования нескольких избыточных зондов для опроса каждого SNP. Зонды предназначены для того, чтобы иметь сайт SNP в нескольких разных местах, а также содержать несоответствия с аллелем SNP. Сравнивая дифференциальную степень гибридизации целевой ДНК с каждым из этих повторяющихся зондов, можно определить конкретные гомозиготные и гетерозиготные аллели.[1] Хотя микроматрицы олигонуклеотидов имеют сравнительно более низкую специфичность и чувствительность, шкала SNP, которые могут быть опрошены, является основным преимуществом. В Affymetrix Human SNP 5.0 GeneChip выполняет полногеномный анализ, позволяющий генотипировать более 500 000 человеческих SNP (Affymetrix 2007).

Ферментные методы

Широкий спектр ферментов, включая ДНК-лигаза, ДНК-полимераза и нуклеазы были использованы для создания методов высокоточного генотипирования SNP.

Полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

Полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) считается самым простым и ранним методом обнаружения SNP. SNP-RFLP использует множество различных эндонуклеаз рестрикции и их высокое сродство к уникальным и специфическим сайтам рестрикции. Выполняя расщепление геномного образца и определяя длину фрагментов с помощью гель-анализа, можно установить, разрезают ли ферменты ожидаемые сайты рестрикции. Неспособность разрезать геномный образец приводит к получению идентифицируемого более крупного, чем ожидалось, фрагмента, что означает наличие мутации в точке сайта рестрикции, обеспечивающей защиту от нуклеазной активности.

К сожалению, сочетание факторов высокой сложности большинства эукариотических геномов, потребности в определенных эндонуклеазах, того факта, что точная мутация не может быть обязательно разрешена в одном эксперименте, и медленный характер гель-анализов делают ПДРФ плохим выбором для высокой производительности. анализ.

Методы на основе ПЦР

Система ПЦР с устойчивой к амплификации тетра-праймером мутаций, или ARMS-PCR, использует две пары праймеров для амплификации двух аллелей в одной реакции ПЦР. Праймеры сконструированы таким образом, что две пары праймеров перекрываются в месте расположения SNP, но каждая идеально соответствует только одному из возможных SNP. Основа изобретения заключается в том, что неожиданно олигонуклеотиды с несовпадающим 3'-остатком не будут функционировать в качестве праймеров в ПЦР в соответствующих условиях.[3] В результате, если данный аллель присутствует в реакции ПЦР, пара праймеров, специфичная для этого аллеля, будет производить продукт, но не для альтернативного аллеля с другим SNP. Две пары праймеров также сконструированы таким образом, что их продукты ПЦР имеют существенно разную длину, что позволяет легко различать полосы с помощью гель-электрофореза или анализа температуры плавления.[4] При изучении результатов, если геномный образец является гомозиготным, то продукты ПЦР, которые будут получены в результате, будут от праймера, который соответствует положению SNP, и внешнего праймера противоположной цепи, а также от двух внешних праймеров. Если геномный образец является гетерозиготным, то продукты будут происходить из праймера каждого аллеля и их соответствующих аналогов внешних праймеров, а также внешних праймеров.

Альтернативная стратегия заключается в проведении нескольких реакций кПЦР с разными наборами праймеров, нацеленных на каждый аллель отдельно. Хорошо сконструированные праймеры будут амплифицировать их целевой SNP на гораздо более раннем цикле, чем другие SNP. Это позволяет различать более двух аллелей, хотя для каждого SNP требуется индивидуальная реакция qPCR. Для достижения достаточно высокой специфичности последовательность праймера может потребовать размещения искусственного несовпадения рядом с его 3'-концом, что является подходом, широко известным как Taq-MAMA.[5]

Эндонуклеаза лоскута

SNP-invader-1.jpg

Эндонуклеаза лоскута (FEN) - эндонуклеаза, катализирующая структурно-специфическое расщепление. Это расщепление очень чувствительно к несовпадениям и может использоваться для опроса SNP с высокой степенью специфичности.[6]

В основном Захватчик проба, FEN, называемый расщеплением, объединяется с двумя специфическими олигонуклеотидными зондами, которые вместе с целевой ДНК могут образовывать трехчастную структуру, распознаваемую расщеплением.[6] Первый зонд, названный Захватчик олигонуклеотид комплементарен 3’-концу целевой ДНК. Последняя база Захватчик олигонуклеотид представляет собой несоответствующее основание, которое перекрывает нуклеотид SNP в целевой ДНК. Второй зонд представляет собой аллель-специфический зонд, который комплементарен 5’-концу целевой ДНК, но также простирается за 3’-сторону нуклеотида SNP. Аллель-специфический зонд будет содержать основание, комплементарное нуклеотиду SNP. Если целевая ДНК содержит желаемый аллель, зонды Invader и аллель-специфичные пробы будут связываться с целевой ДНК, образуя трехчастную структуру. Эта структура распознается расщеплением, которое расщепляет и высвобождает 3 ’конец аллель-специфичного зонда. Если нуклеотид SNP в ДНК-мишени не комплементарен аллель-специфическому зонду, правильная трехчастная структура не образуется и не происходит расщепления. В Захватчик Анализ обычно сочетается с системой резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) для обнаружения события расщепления. В этой установке молекула гасителя прикреплена к 3 ’концу, а флуорофор прикреплен к 5’ концу аллель-специфического зонда. Если происходит расщепление, флуорофор отделяется от молекулы гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал.[6]

Только минимальное расщепление происходит с несовпадающими зондами, что делает Захватчик тест высокоспецифичный. Однако в исходном формате только один аллель SNP мог быть опрошен на образец реакции, и для генерации детектируемого сигнала в разумные сроки требовалось большое количество целевой ДНК.[6] Несколько разработок расширили оригинальный Захватчик проба. Осуществляя вторичные реакции расщепления FEN, Последовательная реакция инвазивного усиления сигнала (SISAR) позволяет опрашивать оба аллеля SNP в одной реакции. SISAR Захватчик для анализа также требуется меньше целевой ДНК, что улучшает чувствительность исходного Захватчик проба.[6] Анализ также был адаптирован несколькими способами для использования в формате с высокой пропускной способностью. На одной платформе аллель-специфические зонды прикреплены к микросферам. Когда расщепление FEN генерирует детектируемый флуоресцентный сигнал, сигнал измеряется с помощью проточной цитометрии. Чувствительность проточной цитометрии устраняет необходимость в ПЦР-амплификации целевой ДНК (Rao et al. 2003). Эти высокопроизводительные платформы не продвинулись дальше стадии подтверждения принципа, и пока Захватчик Система не использовалась ни в одном крупномасштабном проекте генотипирования SNP.[6]

Удлинение грунтовки

Удлинение праймера - это двухэтапный процесс, который сначала включает гибридизацию зонда с основаниями непосредственно перед нуклеотидом SNP с последующей реакцией «мини-секвенирования», в которой ДНК-полимераза удлиняет гибридизованный праймер, добавляя основание, которое комплементарно нуклеотид SNP. Это встроенное основание обнаруживается и определяет аллель SNP (Goelet et al. 1999; Syvanen 2001). Поскольку удлинение праймера основано на использовании высокоточного фермента ДНК-полимеразы, этот метод обычно очень надежен. Удлинение праймера способно генотипировать большинство SNP в очень похожих условиях реакции, что делает его также очень гибким. Метод удлинения праймера используется в нескольких форматах анализа. Эти форматы используют широкий спектр методов обнаружения, включая MALDI-TOF масс-спектрометрия (видеть Sequenom ) и ELISA -подобные методы.[1]

Как правило, существует два основных подхода, в которых используется включение либо флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотиды (ddNTP) или флуоресцентно меченные дезоксинуклеотиды (dNTP). С ddNTP зонды гибридизуются с целевой ДНК непосредственно перед нуклеотидом SNP, и один ddNTP, комплементарный аллелю SNP, добавляется к 3'-концу зонда (отсутствующий 3'-гидроксил в дидиоксинуклеотиде предотвращает добавление дополнительных нуклеотидов. ). Каждый ддНТФ помечен другим флуоресцентным сигналом, что позволяет обнаруживать все четыре аллеля в одной реакции. В случае dNTP аллель-специфические зонды имеют 3 ’основания, комплементарные каждому из опрашиваемых аллелей SNP. Если целевая ДНК содержит аллель, комплементарный 3 ’основанию зонда, целевая ДНК будет полностью гибридизоваться с зондом, позволяя ДНК-полимеразе распространяться от 3’ конца зонда. Это обнаруживается по включению флуоресцентно меченых дНТФ на конец зонда. Если целевая ДНК не содержит аллель, комплементарный 3 ’основанию зонда, целевая ДНК будет давать несоответствие на 3’ конце зонда, и ДНК-полимераза не сможет распространяться от 3 ’конца зонда. Преимущество второго подхода состоит в том, что несколько меченых дНТФ могут включаться в растущую цепь, что обеспечивает усиление сигнала. Однако в некоторых редких случаях ДНК-полимераза может происходить от несовпадающих 3 ’зондов, давая ложноположительный результат.[1]

Другой подход используется Sequenom 's Метод генотипирования iPLEX SNP с использованием масс-спектрометра MassARRAY. Зонды удлинения разработаны таким образом, что 40 различных анализов SNP могут быть амплифицированы и проанализированы в коктейле ПЦР. В реакции удлинения используются ddNTP, как указано выше, но обнаружение аллеля SNP зависит от фактической массы продукта удлинения, а не от флуоресцентной молекулы. Этот метод предназначен для низкой или средней производительности и не предназначен для сканирования всего генома.

Гибкость и специфичность удлинения праймера делают его пригодным для высокопроизводительного анализа. Зонды удлинения праймера могут быть расположены на предметных стеклах, что позволяет генотипировать сразу несколько SNP. Эта технология, широко известная как матричное удлинение праймеров (APEX), имеет несколько преимуществ по сравнению с методами, основанными на дифференциальной гибридизации зондов. Для сравнения, методы APEX обладают большей различающей способностью, чем методы, использующие эту дифференциальную гибридизацию, поскольку часто невозможно получить оптимальные условия гибридизации для тысяч зондов на ДНК-микрочипах (обычно это решается за счет наличия зондов с высокой избыточностью). Однако такая же плотность зондов не может быть достигнута в методах APEX, что приводит к снижению производительности за цикл.[1]

Иллюмина Incorporated Infinium анализ является примером конвейера генотипирования всего генома, основанного на методе удлинения праймера. В анализе Infinium можно генотипировать более 100 000 SNP. В этом анализе используются нуклеотиды, меченные гаптеном, в реакции удлинения праймера. Метка гаптена распознается антителами, которые, в свою очередь, связаны с обнаруживаемым сигналом (Gunderson et al. 2006).

АПЕКС-2 представляет собой метод генотипирования с расширением праймеров, который позволяет идентифицировать сотни SNP или мутаций параллельно с использованием эффективных гомогенных мультиплексная ПЦР (до 640 плекс) и четырехцветное одноосновное расширение на микрочипе. Мультиплексная ПЦР требует двух олигонуклеотидов на каждый SNP / мутацию, генерирующую ампликоны, содержащие тестируемую пару оснований. Те же олигонуклеотиды используются на следующем этапе в качестве иммобилизованных одноосновных праймеров для удлинения на микроматрице (Krjutskov et al. 2008).

5’-нуклеаза

5’-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq используется в TaqMan анализ на генотипирование SNP. В TaqMan анализ проводится одновременно с реакцией ПЦР, и результаты можно считывать в режиме реального времени по мере протекания реакции ПЦР (McGuigan & Ralston 2002). Для анализа требуются прямые и обратные праймеры для ПЦР, которые будут амплифицировать область, включающую полиморфный сайт SNP. Дискриминация аллелей достигается с помощью FRET в сочетании с одним или двумя аллель-специфическими зондами, которые гибридизуются с полиморфным сайтом SNP. Зонды будут иметь флуорофор, связанный с их 5 ’концом, и молекулу гасителя, связанную с их 3’ концом. Пока зонд не поврежден, гаситель будет оставаться в непосредственной близости от флуорофора, устраняя сигнал флуорофора. На этапе амплификации ПЦР, если аллель-специфический зонд полностью комплементарен аллелю SNP, он будет связываться с цепью ДНК-мишени и затем разрушаться 5'-нуклеазной активностью полимеразы Taq, поскольку она расширяет ДНК из ПЦР. грунтовки. Разложение зонда приводит к отделению флуорофора от молекулы гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал. Если аллель-специфический зонд не является полностью комплементарным, он будет иметь более низкую температуру плавления и связываться не так эффективно. Это предотвращает действие нуклеазы на зонд (McGuigan & Ralston 2002).

Поскольку TaqMan анализ основан на ПЦР, его относительно просто реализовать. В TaqMan Анализ можно объединить, объединив обнаружение до семи SNP в одной реакции. Однако, поскольку для каждого SNP требуется отдельный зонд, TaqMan анализ ограничен тем, насколько близко могут быть расположены SNP. Масштаб анализа можно резко увеличить, выполняя множество одновременных реакций в микротитровальных планшетах. В общем, TaqMan ограничивается приложениями, которые включают опрос небольшого числа SNP, поскольку для каждого SNP должны быть разработаны оптимальные зонды и условия реакции (Syvanen 2001).

Анализ лигирования олигонуклеотидов

ДНК-лигаза катализирует лигирование 3'-конца фрагмента ДНК с 5'-концом непосредственно прилегающего фрагмента ДНК. Этот механизм можно использовать для опроса SNP путем гибридизации двух зондов непосредственно над полиморфным сайтом SNP, в результате чего может происходить лигирование, если зонды идентичны целевой ДНК. В анализе олигонуклеотидной лигазы сконструированы два зонда; аллель-специфический зонд, который гибридизуется с целевой ДНК, так что его 3'-основание расположено непосредственно над нуклеотидом SNP, и второй зонд, который гибридизирует матрицу выше (ниже по течению в комплементарной цепи) полиморфного сайта SNP, обеспечивая 5'-конец для реакции лигирования. Если аллель-специфический зонд совпадает с целевой ДНК, он полностью гибридизуется с целевой ДНК, и может произойти лигирование. Лигирование обычно не происходит в присутствии несоответствующего 3'-основания. Лигированные или нелигированные продукты могут быть обнаружены гель-электрофорезом, масс-спектрометрией MALDI-TOF или капиллярным электрофорезом для крупномасштабных приложений.[1] С соответствующими последовательностями и метками на олигонуклеотидах можно получить высокопроизводительные данные о последовательностях из лигированных продуктов и определенных генотипов (Curry et al., 2012). Использование большого количества индексов выборки позволяет сгенерировать данные последовательности с высокой пропускной способностью для сотен SNP в тысячах выборок за небольшую часть цикла высокопроизводительного секвенирования. Это массовое генотипирование с помощью технологии секвенирования (MGST).

Другие методы постамплификации, основанные на физических свойствах ДНК

Характерные свойства ДНК температуры плавления и однонитевой конформации использовались в нескольких приложениях для различения аллелей SNP. Эти методы очень часто достигают высокой специфичности, но требуют высоко оптимизированных условий для получения наилучших возможных результатов.

Однонитевой конформационный полиморфизм

Основная статья: Однониточная_конформационная_полиморфизм

Одноцепочечная ДНК (оцДНК) складывается в третичную структуру. Конформация зависит от последовательности, и большинство мутаций одной пары оснований изменяют форму структуры. При нанесении на гель третичная форма будет определять подвижность оцДНК, обеспечивая механизм различения аллелей SNP. Этот метод сначала включает ПЦР-амплификацию целевой ДНК. Двухцепочечные продукты ПЦР денатурируют с использованием тепла и формальдегида для получения оцДНК. ОцДНК наносят на неденатурирующий гель для электрофореза и дают возможность свернуться в третичную структуру. Различия в последовательности ДНК изменят третичную конформацию и будут обнаружены как различие в подвижности цепи оцДНК (Costabile et al. 2006). Этот метод широко используется, поскольку он технически прост, относительно недорог и требует использования общедоступного оборудования. Однако по сравнению с другими методами генотипирования SNP чувствительность этого анализа ниже. Было обнаружено, что конформация оцДНК сильно зависит от температуры, и, как правило, не очевидно, какова идеальная температура. Очень часто анализ будет проводиться с использованием нескольких различных температур. Также существует ограничение на длину фрагмента, потому что чувствительность падает, когда используются последовательности длиннее 400 п.н. (Costabile et al. 2006).

Гель-электрофорез в градиенте температуры

SNP-DHPLC-TGGE-1updated.jpg

В гель-электрофорез в градиенте температуры (TGGE) или метод капиллярного электрофореза в температурном градиенте (TGCE) основан на том принципе, что частично денатурированная ДНК более ограничена и медленнее перемещается в пористом материале, таком как гель. Это свойство позволяет разделять ДНК по температуре плавления. Чтобы адаптировать эти методы для обнаружения SNP, используются два фрагмента; целевая ДНК, которая содержит исследуемый полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем повторно отжигают. Если целевая ДНК имеет тот же аллель, что и нормальный фрагмент, образуются гомодуплексы с одинаковой температурой плавления. При работе на геле с градиентом температуры появится только одна полоса. Если целевая ДНК имеет отдельный аллель, после стадии повторного отжига образуются четыре продукта; гомодуплексы, состоящие из целевой ДНК, гомодуплексы, состоящие из нормальной ДНК, и два гетеродуплекса каждой цепи целевой ДНК, гибридизованные с нормальной цепью ДНК. Эти четыре продукта будут иметь разные температуры плавления и появятся в денатурирующем геле в виде четырех полос.[1]

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография

Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC) использует обратную фазу ВЭЖХ для опроса SNP. Ключ к DHPLC - это твердая фаза, которая имеет дифференциальное сродство к одноцепочечной и двухцепочечной ДНК. В DHPLC фрагменты ДНК денатурируют нагреванием, а затем дают возможность повторно отожиться. Температура плавления повторно отожженных фрагментов ДНК определяет продолжительность времени, в течение которого они остаются в колонке.[7] Используя ПЦР, генерируют два фрагмента; ДНК-мишень, содержащая полиморфный сайт SNP и аллель-специфичную последовательность ДНК, называемую нормальным фрагментом ДНК. Этот нормальный фрагмент идентичен целевой ДНК, за исключением потенциально полиморфного сайта SNP, который неизвестен в целевой ДНК. Фрагменты денатурируют, а затем дают возможность постепенно реанимировать. Реантированные продукты добавляют в колонку DHPLC. Если аллель SNP в целевой ДНК совпадает с нормальным фрагментом ДНК, только идентичные гомодуплексы будут формироваться во время стадии повторного отжига. Если целевая ДНК содержит аллель SNP, отличный от нормального фрагмента ДНК, в дополнение к гомодуплексам будут образовываться гетеродуплексы целевой ДНК и нормальной ДНК, содержащие несовпадающий полиморфный сайт. Несоответствующие гетеродуплексы будут иметь другую температуру плавления, чем гомодуплексы, и не будут удерживаться в колонке так долго. Это создает образец хроматографии, который отличается от образца, который был бы сгенерирован, если бы целевой фрагмент ДНК и нормальные фрагменты ДНК были идентичны. Элюированную ДНК обнаруживают по УФ-поглощению.[7]

DHPLC легко автоматизировать, так как не требуется мечение или очистка фрагментов ДНК. Этот метод также относительно быстр и отличается высокой специфичностью. Одним из основных недостатков DHPLC является то, что температура колонки должна быть оптимизирована для каждой мишени, чтобы достичь нужной степени денатурации.[1]

Плавление всего ампликона с высоким разрешением

Анализ плавления с высоким разрешением это самый простой для понимания метод, основанный на ПЦР. По сути, здесь и в реальном времени применяются те же термодинамические свойства, которые позволили гелевым методам работать. Флуориметр отслеживает денатурацию всего ампликона дцДНК после ПЦР. Вы делаете праймеры, специфичные для сайта, который хотите амплифицировать. Вы «окрашиваете» ампликон двухцепочечным специфическим красителем, включенным в смесь для ПЦР. Краситель, специфичный для ds, интегрируется в продукт ПЦР. По сути, весь ампликон становится зондом. Это открывает новые возможности для открытий. Либо вы размещаете праймеры очень близко по обе стороны от рассматриваемого SNP (генотипирование малых ампликонов, Liew, 2004), либо амплифицируете более крупную область (длиной 100-400 п.н.) для целей сканирования. Для простого генотипирования SNP проще сделать ампликон маленьким, чтобы свести к минимуму вероятность того, что вы перепутаете один SNP с другим. Определяется температура плавления (Tm) всего ампликона, и большинство гомозигот достаточно различаются (в лучших инструментах) по Tm от генотипа. Гетерозиготы еще легче дифференцировать, потому что они генерируют гетеродуплексы (см. Пояснения на основе геля), которые расширяют переход расплава и обычно дают два различимых пика. Описано плавление ампликона с использованием флуоресцентно меченного праймера (Gundry et al., 2003), но оно менее практично, чем использование ds-специфичных красителей из-за стоимости флуорогенного праймера.

Сканирование больших ампликонов основано на тех же принципах, что указаны выше. Однако информативными становятся температура плавления и общая форма кривой плавления. Для ампликонов размером> 150 п.н. часто имеется> 2 пика плавления, каждый из которых может варьироваться в зависимости от состава матрицы ДНК. Многочисленные исследователи смогли успешно устранить большую часть своего секвенирования с помощью сканирования на основе расплава, что позволило точно определить генотипирование на основе локуса большого числа людей.[8] Многие исследователи обнаружили, что сканирование мутаций с использованием плавления с высоким разрешением является жизнеспособным и практичным способом изучения целых генов.

Использование белков, связывающих несовпадение ДНК

Белки, связывающие несовпадения ДНК, могут различать единичные несоответствия нуклеотидов и, таким образом, облегчать дифференциальный анализ SNP. Например, белок MutS из Thermus aquaticus связывает разные однонуклеотидные несовпадения с разным сродством и может быть использован в капиллярном электрофорезе для дифференциации всех шести наборов несовпадений (Drabovich & Krylov 2006).

SNPlex

Основная статья: SNPlex

SNPlex - это запатентованная платформа для генотипирования, продаваемая Прикладные биосистемы.

Сюрвейерский анализ нуклеазы

Основная статья: Surveyor_nuclease_assay

Нуклеаза Surveyor представляет собой фермент эндонуклеазы несовпадения, который распознает все замены оснований и небольшие вставки / делеции (инделки) и расщепляет 3'-сторону несовпадающих сайтов в обеих цепях ДНК.

Последовательность действий

Дальнейшая информация: Вызов SNV из данных NGS

Секвенирование нового поколения такие технологии как пиросеквенирование последовательность менее 250 оснований в считывании, что ограничивает их способность секвенировать целые геномы. Тем не менее, их способность генерировать результаты в режиме реального времени и их потенциал для массового масштабирования делает их жизнеспособным вариантом для секвенирования небольших областей для выполнения генотипирования SNP. По сравнению с другими методами генотипирования SNP, секвенирование, в частности, подходит для идентификации нескольких SNP в небольшом регионе, таком как высокополиморфный Главный комплекс гистосовместимости область генома.[1]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм час я j k Harbron S; Рэпли Р. (2004). Молекулярный анализ и открытие генома. Лондон: John Wiley & Sons Ltd. ISBN  978-0-471-49919-0.
  2. ^ Howell WM; Работа M; Gyllensten U; Брукс AJ (январь 1999 г.). «Динамическая аллель-специфическая гибридизация. Новый метод оценки однонуклеотидных полиморфизмов». Nat. Биотехнология. 17 (1): 87–8. Дои:10.1038/5270. PMID  9920276.
  3. ^ Ньютон Ч. Р., Грэм А., Хептинстолл Л. Е., Пауэлл С. Дж., Саммерс К., Калшекер Н., Смит Дж. К., Маркхэм А. Ф. (1989). «Анализ любой точечной мутации в ДНК. Система устойчивых к амплификации мутаций (ARMS)». Исследования нуклеиновых кислот. 17 (7): 2503–2516. Дои:10.1093 / nar / 17.7.2503. ЧВК  317639. PMID  2785681.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  4. ^ Бердселл Д. Н., Пирсон Т., Прайс Э. П., Хорнстра Х. М., Нера Р. Д., Стоун Н.; и другие. (2012). «Анализ расплава в анализах мутации амплификации с несоответствием (Melt-MAMA): функциональное исследование рентабельного анализа генотипирования SNP в бактериальных моделях». PLOS ONE. 7 (3): e32866. Дои:10.1371 / journal.pone.0032866.s002.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  5. ^ Ли Б., Кадура И., Фу Д.-Дж., Уотсон Д. Э. (2004). «Генотипирование с помощью TaqMAMA». Геномика. 83 (2): 311–320. Дои:10.1016 / j.ygeno.2003.08.005. PMID  14706460.CS1 maint: несколько имен: список авторов (связь)
  6. ^ а б c d е ж Оливье М (июнь 2005 г.). «Тест Invader для генотипирования SNP». Мутат. Res. 573 (1–2): 103–10. Дои:10.1016 / j.mrfmmm.2004.08.016. ЧВК  2771639. PMID  15829241.
  7. ^ а б Oefner PJ; Андерхилл, Пенсильвания (1995). «Сравнительное секвенирование ДНК путем денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC)». Am J Hum Genet. 57: 103–10.
  8. ^ (Данг и др., 2012)

дальнейшее чтение

внешняя ссылка