Удлинение грунтовки - Primer extension

Обзор праймера-удлинителя. Интересующий транскрипт содержит урацил на уровне +1 (неизвестно до анализа). 2) Синтезировать праймер с 5’-концом (с использованием [γ32P] ATP. 3) Сделать кДНК путем удлинения праймера с помощью обратной транскриптазы до 5’-конца транскрипта. 4) Результатом является кДНК расширенного праймера с радиоактивной меткой, которая денатурируется и отделяется на полиакриламидном геле и обнаруживается авторадиографией. Как правило, лестница секвенирования с использованием того же праймера также находится на геле, что позволяет быстро идентифицировать нуклеотид +1 (показан фиолетовым).

Удлинение грунтовки это техника, с помощью которой 5 'концов из РНК могут быть отображены, то есть их можно упорядочить и правильно идентифицировать.

Удлинение праймера можно использовать для определения стартового сайта транскрипции (конечный сайт не может быть определен этим методом), по которому известна его последовательность. Для этого метода требуется праймер с радиоактивной меткой (обычно длиной 20-50 нуклеотидов), который комплементарен области около 3'-конца мРНК. Праймеру дают отжигаться с РНК, и обратная транскриптаза используется для синтеза кДНК от РНК до тех пор, пока не достигнет 5'-конца РНК. Путем денатурирования гибрида и использования кДНК удлиненного праймера в качестве маркера на электрофоретическом геле можно определить сайт начала транскрипции. Обычно это делается путем сравнения его местоположения на геле с последовательностью ДНК (например, Секвенирование по Сэнгеру ), предпочтительно с использованием одного и того же праймера на цепи матрицы ДНК. Точный нуклеотид, с которого начинается транскрипция, может быть точно определен путем сопоставления меченого удлиненного праймера с нуклеотидом-маркером, которые оба имеют одинаковое расстояние миграции в геле.

Праймер-удлинитель предлагает альтернативу анализ защиты от нуклеаз (Картирование нуклеазы S1) для количественной оценки и картирования транскриптов РНК. В гибридизационный зонд для удлинения праймера представляет собой синтезированный олигонуклеотид, тогда как Отображение S1 требует выделения фрагмента ДНК. Оба метода предоставляют информацию о том, где начинается мРНК, и обеспечивают оценку концентрации транскрипта по интенсивности полосы транскрипта на полученном авторадиографе. Однако, в отличие от картирования S1, удлинение праймера можно использовать только для определения местоположения 5’-конца транскрипта мРНК, потому что синтез ДНК, необходимый для анализа, зависит от обратной транскриптазы (полимеризуется только в направлении 5 ’→ 3’).

На удлинение праймера не влияют сайты сплайсинга, и поэтому оно предпочтительно в ситуациях, когда промежуточные сайты сплайсинга препятствуют картированию S1. Наконец, удлинение праймера более точное, чем отображение S1, потому что Нуклеаза S1 используемый в картировании S1 может «откусить» концы гибрида РНК-ДНК или не разрушить одноцепочечные области полностью, в результате чего транскрипт будет казаться короче или длиннее.

Рекомендации

• https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/primer-extension
• Шенк Т. Э., К. Родс, П. У. Дж. Ригби и П. Берг. «Биохимическая процедура для производства небольших делеций в ДНК обезьяньего вируса 40». Proccedings of the National Academy of Sciences 72.4 (1975): 1392-396. Распечатать.