Живое изображение одной клетки - Live single-cell imaging

В системная биология, живые одноклеточные изображения это визуализация живых клеток метод, сочетающий традиционную визуализацию живых клеток и покадровая микроскопия методы с автоматическим отслеживанием клеток и извлечением признаков, используя многие методы из высококонтентный просмотр. Он используется для изучения динамики и поведения сигналов в популяциях отдельных живых клеток.[1][2] Исследования живых одиночных клеток могут выявить ключевые модели поведения, которые в противном случае были бы замаскированы в экспериментах по усреднению популяции, таких как вестерн-блоты.[3]

В эксперименте по визуализации живых клеток флуоресцентный репортер вводят в клеточную линию для измерения уровней, локализации или активности сигнальной молекулы. Впоследствии популяция клеток визуализируется с течением времени при тщательном атмосферном контроле для поддержания жизнеспособности и снижения нагрузки на клетки. Затем над этими изображениями временных рядов выполняется автоматическое отслеживание ячеек, после чего могут выполняться фильтрация и контроль качества. Анализ характеристик, описывающих флуоресцентный репортер с течением времени, может затем привести к моделированию и созданию биологических выводов, на основе которых можно будет руководствоваться дальнейшими экспериментами.

История

Область живых одноклеточных изображений началась с работы, демонстрирующей, что зеленый флуоресцентный белок (GFP), найденный в медузах Aequorea victoria, могли быть выражены в живых организмах.[4] Это открытие позволило исследователям изучить локализацию и уровни белков в живых одиночных клетках, например, активность киназы,[5] и кальций уровней, за счет использования FRET репортеры,[6] а также множество других фенотипов.[7]

Как правило, эти ранние исследования были сосредоточены на локализации и поведении этих флуоресцентно меченных белков на субклеточном уровне в течение коротких периодов времени. Однако это изменилось с новаторскими исследованиями, посвященными супрессору опухолей. p53[8] и белок, связанный со стрессом и воспалением NF-κB,[9] обнаруживая там уровни и локализацию, соответственно, чтобы колебаться в течение нескольких часов. Примерно в это же время также применялись подходы с использованием живых клеток для понимания передачи сигналов в одноклеточных организмах, включая бактерии, где живые исследования позволили смоделировать динамику компетентности.[10] и дрожжи, раскрывающие механизм, лежащий в основе последовательного входа в клеточный цикл.[11]

Схема экспериментальной работы

Флуоресцентные репортеры

В любом исследовании живых одиночных клеток первым шагом является введение репортера нашего белка / представляющей интерес молекулы в подходящую клеточную линию. Значительный рост в этой области произошел за счет улучшенных инструментов редактирования генов, таких как CRISPR, что привело к развитию широкого спектра флуоресцентных репортеров.[12]

Флуоресцентная метка использует ген, кодирующий флуоресцентный белок, который вставляется в кодирующую рамку белка, который нужно метить. Характеристики текстуры и интенсивности могут быть извлечены из изображений помеченного белка.

Также можно пометить молекулы in vitro и введен в камеру с электрофорез. Это позволяет использовать более мелкие и более фотостабильные флуофоры, но требует дополнительных этапов промывки.[13]

Путем конструирования экспрессии репортера FRET таким образом, чтобы флуорофоры донора и эмиттера находились только в непосредственной близости, когда сигнальная молекула выше по течению либо активна, либо неактивна, соотношение интенсивностей флуоресценции донора к эмиттеру можно использовать в качестве меры сигнальной активности. Например, в ключевых ранних работах с использованием репортеров FRET для живых одиночных исследований репортеры FRET Rho GTPase деятельность были спроектированы.[14]

Репортеры о ядерной транслокации используют инженерные ядерный импорт и ядерный экспорт сигналы, которые могут подавляться сигнальными молекулами, для регистрации сигнальной активности через соотношение ядерного репортера к цитоплазматическому репортеру.[15]

Живое изображение

Затем необходимо выполнить визуализацию живых клеток флуоресцентно меченых клеток. Это требует одновременной инкубации клеток в условиях отсутствия стресса во время визуализации. При выборе условий визуализации необходимо учитывать несколько факторов, таких как фототоксичность, фотообесцвечивание, легкость отслеживания, скорость изменения активности сигналов и сигнал-шум. Все это относится к частоте изображения и интенсивности освещения.

Фототоксичность может возникать в результате длительного воздействия большого количества света. Клетки подвергаются стрессу, что может привести к апоптозу. Визуализация с высокой частотой и интенсивностью может вызвать снижение сигнала флуорофора из-за фотообесцвечивания. Получение изображений с более высокой частотой обычно упрощает автоматическое отслеживание клеток. Частоты визуализации должны улавливать необходимые изменения сигнальной активности. Визуализация низкой интенсивности или плохие репортеры могут помешать обнаружению низких уровней сигнальной активности внутри клетки.

Отслеживание живых клеток

После получения изображений живых клеток используется программное обеспечение автоматического отслеживания для извлечения данных временных рядов из видеозаписей клеток. Отслеживание живых клеток обычно делится на два этапа: сегментация изображений клеток или их ядер и отслеживание клеток / ядер на основе этих сегментов. Многие проблемы все еще существуют на этом этапе исследования изображений живых одиночных клеток.[16] Однако недавний прогресс был отмечен в области первого объективного сравнения методов отслеживания отдельных ячеек.[17]

Количественная фазовая визуализация (QPI) особенно полезен для отслеживания живых клеток. Поскольку QPI не содержит этикеток, он не вызывает фототоксичности и не страдает от фотообесцвечивания, связанного с флуоресцентной визуализацией.[18] QPI предлагает значительно более высокий контраст, чем традиционные методы фазовой визуализации, такие как фазово-контрастная микроскопия. Более высокий контраст способствует более надежной сегментации и отслеживанию клеток, чем это достигается с помощью традиционной фазовой визуализации.[19]

Также все более широко используются новые методы, в которых используется сочетание традиционных методов сегментации изображений и глубокого обучения для сегментации ячеек.[20]

Анализ данных

На заключительном этапе исследования визуализации живых клеток выполняется моделирование и анализ данных временных рядов, извлеченных из отслеживаемых клеток. Профили дерева родословных могут быть построены для выявления неоднородности в ответе отдельных клеток и последующей передаче сигналов.[21] Большое совпадение между анализом живых данных отдельных клеток и моделированием биологических систем с использованием обыкновенные дифференциальные уравнения существуют. Результаты этого этапа анализа ключевых данных будут стимулировать дальнейшие эксперименты, например, путем возмущения аспектов изучаемой системы и последующего сравнения динамики передачи сигналов с динамикой контрольной популяции.

Приложения

Анализируя динамику передачи сигналов отдельными клетками во всей популяции, исследования живых отдельных клеток теперь позволяют нам понять, как эта динамика влияет на ключевые клеточные процессы принятия решений. Например, живые одноклеточные исследования фактора роста ERK показал, что он обладает цифровой активацией по принципу "все или ничего".[22] Более того, эта активация по принципу «все или ничего» была импульсной, и частота импульсов, в свою очередь, определяла, будут ли клетки млекопитающих совершать вход в клеточный цикл или нет. В другом ключевом примере живые одноклеточные исследования CDK2 активность в клетках млекопитающих продемонстрировала, что бифуркация активности CDK2 после митоза определяет, будут ли клетки продолжать пролиферировать или переходить в состояние покоя;[23] теперь показано, с использованием методов живых одиночных клеток, что вызвано стохастическим повреждением ДНК, вызывающим повышенную регуляцию стр.21, который подавляет активность CDK2.[24] Двигаясь вперед, исследования живых одиночных клеток теперь, вероятно, объединят несколько репортеров в отдельные клеточные линии, чтобы можно было понять сложные процессы принятия решений, однако все еще остаются проблемы с расширением масштабов исследований живых одиночных клеток.

Рекомендации

  1. ^ Годе, Сюзанна; Миллер-Дженсен, Кэтрин (2016). «Новое определение путей передачи сигналов с помощью расширяющегося набора инструментов для отдельных ячеек». Тенденции в биотехнологии. 34 (6): 458–469. Дои:10.1016 / j.tibtech.2016.02.009. ЧВК  4958913. PMID  26968612.
  2. ^ Купер, Сэм; Бакал, Крис (2017). «Ускорение исследований передачи сигналов в реальном времени». Тенденции в биотехнологии. 35 (5): 422–433. Дои:10.1016 / j.tibtech.2017.01.002. PMID  28161141.
  3. ^ Purvis, Jerem E .; Лахав, Галит (2013). «Кодирование и декодирование сотовой информации через динамику сигнализации». Клетка. 152 (5): 945–956. Дои:10.1016 / j.cell.2013.02.005. ЧВК  3707615. PMID  23452846.
  4. ^ Чалфи, Мартин. «Зеленый флуоресцентный белок как маркер экспрессии генов». Тенденции в генетике 10.5 (1994): 151.
  5. ^ Нг, Т. (1999). «Визуализация активации протеинкиназы C в клетках». Наука. 283 (5410): 2085–2089. Bibcode:1999Научный ... 283.2085N. Дои:10.1126 / science.283.5410.2085. PMID  10092232.
  6. ^ Tsien, Roger Y .; Мияваки, Ацуши; Ллопис, Хуан; Хайм, Роджер; Маккаффери, Дж. Майкл; Адамс, Джозеф А .; Икура, Мицухико (1997). «Флуоресцентные индикаторы Са2 + на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина». Природа. 388 (6645): 882–887. Bibcode:1997Натура.388..882М. Дои:10.1038/42264. PMID  9278050. S2CID  13745050.
  7. ^ Цзянь, Р. Ю. (1998). «БИОХИМИЧЕСКОЕ ИЗОБРАЖЕНИЕ: Увидеть механизм живых клеток». Наука. 280 (5371): 1954–1955. Дои:10.1126 / science.280.5371.1954. PMID  9669950. S2CID  1666177.
  8. ^ Лахав, Галит; Розенфельд, Ницан; Сигал, Алекс; Гева-Заторский, Наама; Левин, Арнольд Дж; Elowitz, Майкл Б.; Алон, Ури (2004). «Динамика петли обратной связи p53-Mdm2 в отдельных клетках». Природа Генетика. 36 (2): 147–150. Дои:10,1038 / ng1293. PMID  14730303.
  9. ^ Нельсон, Д. Э. (2004). «Колебания в передаче сигналов NF-kB контролируют динамику экспрессии генов». Наука. 306 (5696): 704–708. Дои:10.1126 / science.1099962. PMID  15499023. S2CID  86055964.
  10. ^ Süel, Gürol M .; Гарсия-Охалво, Хорди; Либерман, Луиза М .; Elowitz, Майкл Б. (2006). «Схема регуляции возбудимого гена вызывает временную клеточную дифференциацию» (PDF). Природа. 440 (7083): 545–550. Bibcode:2006Натура.440..545S. Дои:10.1038 / природа04588. PMID  16554821. S2CID  4327745.
  11. ^ Skotheim, Jan M .; Талия, Стефано Ди; Сиггиа, Эрик Д .; Кросс, Фредерик Р. (2008). «Положительная обратная связь циклинов G1 обеспечивает последовательный вход в клеточный цикл». Природа. 454 (7202): 291–296. Bibcode:2008Натура.454..291S. Дои:10.1038 / природа07118. ЧВК  2606905. PMID  18633409.
  12. ^ Шарма, Арун; Toepfer, Christopher N .; Уорд, Тарша; Уоссон, Лорен; Агарвал, Радхика; Коннер, Дэвид А .; Ху, Джонни Х .; Зайдман, Кристин Э. (24 января 2018 г.). «CRISPR / Cas9-опосредованное флуоресцентное мечение эндогенных белков в плюрипотентных стволовых клетках человека». Текущие протоколы в генетике человека. 96: 21.11.1–21.11.20. Дои:10.1002 / cphg.52. ISSN  1934-8266. ЧВК  5785097. PMID  29364519.
  13. ^ Кроуфорд, Роберт; Торелла, Джозеф П .; Эгрейн, Луиза; Плоховец, Анна; Грайте, Кристофер; Апхофф, Стефан; Капанидис, Ахиллефс Н. (2013-12-03). «Долгоживущая внутриклеточная флуоресценция одиночных молекул с использованием электропорированных молекул». Биофизический журнал. 105 (11): 2439–2450. Bibcode:2013BpJ ... 105.2439C. Дои:10.1016 / j.bpj.2013.09.057. ISSN  0006-3495. ЧВК  3853080. PMID  24314075.
  14. ^ Перц, Оливье; Ходжсон, Луи; Klemke, Richard L .; Хан, Клаус М. (2006). «Пространственно-временная динамика активности RhoA в мигрирующих клетках». Природа. 440 (7087): 1069–1072. Bibcode:2006 Натур.440.1069П. Дои:10.1038 / природа04665. PMID  16547516. S2CID  4401450.
  15. ^ Регот, Серги; Хьюги, Джейкоб Дж .; Bajar, Bryce T .; Карраско, Сильвия; Covert, Маркус В. (2014). «Высокочувствительные измерения множественной активности киназ в живых одиночных клетках». Клетка. 157 (7): 1724–1734. Дои:10.1016 / j.cell.2014.04.039. ЧВК  4097317. PMID  24949979.
  16. ^ Скилаки, Ставроула; Хильзенбек, Оливер; Шредер, Тимм (2016). «Проблемы в долгосрочной визуализации и количественной оценки динамики отдельных клеток». Природа Биотехнологии. 34 (11): 1137–1144. Дои:10.1038 / nbt.3713. PMID  27824848. S2CID  17548070.
  17. ^ Маска, М .; Ульман, В .; Свобода, Д .; Matula, P .; Matula, P .; Ederra, C .; Урбиола, А .; Espana, T .; Venkatesan, S .; Балак, Д. М. З .; Карась, П .; Болькова, Т .; Стрейтова, М .; Carthel, C .; Coraluppi, S .; Harder, N .; Rohr, K .; Магнуссон, К. Э. Г .; Jalden, J .; Blau, H.M .; Дзюбачык, О .; Krizek, P .; Hagen, G.M .; Pastor-Escuredo, D .; Jimenez-Carretero, D .; Ledesma-Carbayo, M.J .; Munoz-Barrutia, A .; Meijering, E .; Козубек, М .; Ортис-де-Солорзано, К. (2014). «Тест для сравнения алгоритмов отслеживания ячеек». Биоинформатика. 30 (11): 1609–1617. Дои:10.1093 / биоинформатика / btu080. ЧВК  4029039. PMID  24526711.
  18. ^ Пак, Ёнкын; Деперсинг, Кристиан; Попеску, Габриэль (27 сентября 2018 г.). «Количественная фазовая визуализация в биомедицине». Природа Фотоника. 12 (10): 578–589. Bibcode:2018НаФо..12..578П. Дои:10.1038 / с41566-018-0253-х. PMID  26648557. S2CID  126144855.
  19. ^ Каспрович, Ричард; Суман, Ракеш; О’Тул, Питер (1 марта 2017 г.). «Характеристика поведения живых клеток: традиционные подходы без меток и количественной фазовой визуализации». Международный журнал биохимии и клеточной биологии. 84: 89–95. Дои:10.1016 / j.biocel.2017.01.004. ISSN  1357-2725. PMID  28111333.
  20. ^ Ван, Вэйкан; Taft, David A .; Чен, И-Цзюнь; Чжан, Цзинъюй; Wallace, Callen T .; Сюй, Мин; Уоткинс, Саймон С .; Син, Цзяньхуа (май 2019 г.). «Научитесь сегментировать отдельные клетки с помощью оценщика глубокого расстояния и детектора глубоких клеток». Компьютеры в биологии и медицине. 108: 133–141. Дои:10.1016 / j.compbiomed.2019.04.006. ISSN  1879-0534. ЧВК  6781873. PMID  31005005.
  21. ^ Korsnes, Mónica S .; Корснес, Райнерт (2018). «Одноклеточное отслеживание клеток рака легкого A549, подвергшихся воздействию морского токсина, выявляет корреляции в профилях родословных деревьев». Границы онкологии. 8: 260. Дои:10.3389 / fonc.2018.00260. ЧВК  6039982. PMID  30023341.
  22. ^ Олбек, Джон Дж .; Миллс, Гордон Б .; Брюгге, Джоан С. (2013). «Частотно-модулированные импульсы активности ERK, передающие количественные сигналы распространения». Молекулярная клетка. 49 (2): 249–261. Дои:10.1016 / j.molcel.2012.11.002. ЧВК  4151532. PMID  23219535.
  23. ^ Спенсер, Сабрина Л .; Cappell, Steven D .; Цай, Фэн-Цзяо; Овертон, К. Уэсли; Wang, Clifford L .; Мейер, Тобиас (2013). «Решение о пролиферации-покое контролируется бифуркацией активности CDK2 при выходе из митоза». Клетка. 155 (2): 369–383. Дои:10.1016 / j.cell.2013.08.062. ЧВК  4001917. PMID  24075009.
  24. ^ Барр, Алексис Р .; Купер, Сэмюэл; Heldt, Frank S .; Бутера, Франческа; Стой, Генриетта; Мансфельд, Йорг; Новак, Бела; Бакал, Крис (2017). «Повреждение ДНК во время S-фазы опосредует решение о прекращении пролиферации в последующем G1 через экспрессию p21». Nature Communications. 8: 14728. Bibcode:2017НатКо ... 814728B. Дои:10.1038 / ncomms14728. ЧВК  5364389. PMID  28317845.