Джин нокдаун - Gene knockdown

Джин нокдаун экспериментальный метод, с помощью которого выражение одного или нескольких организм с гены уменьшен. Снижение может происходить либо через генетическая модификация или обработкой реагент например, короткая ДНК или РНК олигонуклеотид который имеет последовательность, комплементарную либо гену, либо транскрипту мРНК.[1]

Против временного нокдауна

Если ДНК организма является генетически модифицированным, получившийся организм называется «нокдаун организмом». Если изменение экспрессия гена вызвано олигонуклеотид привязка к мРНК или временная привязка к ген, это приводит к временному изменению экспрессии генов, которое не модифицирует хромосомную ДНК, и этот результат называется «временным нокдауном».[1]

При временном нокдауне связывание этого олигонуклеотида с активным геном или его транскриптами вызывает снижение экспрессии посредством различных процессов. Связывание может происходить либо через блокировку транскрипция (в случае связывания генов) деградация мРНК транскрипт (например, малой интерферирующей РНК (миРНК )) или же РНКаза -H-зависимый антисмысловой или через блокирование любого мРНК перевод, pre-mСплайсинг РНК сайты, или нуклеаза сайты расщепления, используемые для созревания других функциональных РНК, включая miRNA (например, морфолино oligos или другой антисмысловой, независимый от РНКазы-H).[1][2]

Наиболее прямое использование переходных нокдаунов - это изучение ген это было последовательный, но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика. Исследователи делают выводы из того, чем нокдаун отличается от людей, у которых работает интересующий ген. Переходные нокдауны часто используются в биология развития потому что олигонуклеотиды можно вводить в одноклеточные зиготы и будет присутствовать в дочерних клетках инъецированной клетки через эмбриональный разработка.[3] Термин "генный нокдаун" впервые появился в литературе в 1994 году.[4]

РНК-интерференция

РНК-интерференция (RNAi) - это средство подавления генов посредством деградации мРНК.[5] Нокдаун гена этим методом достигается путем введения небольших двухцепочечных интерферирующих РНК (миРНК) в цитоплазму. Небольшие интерферирующие РНК могут происходить изнутри клетки или могут вводиться в клетку экзогенно. После введения в клетку экзогенные миРНК процессируются РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC ).[6] МиРНК комплементарна целевой мРНК, которая должна быть заглушена, и RISC использует миРНК в качестве матрицы для определения местоположения целевой мРНК. После того, как RISC локализуется на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой.

РНКи широко используется в качестве лабораторного метода генетического функционального анализа.[7] РНКи в таких организмах, как C. elegans и Drosophila melanogaster обеспечивает быстрое и недорогое средство исследования функции генов. В C. elegans исследования, наличие таких инструментов, как Библиотека Ahringer RNAi дать лабораториям возможность тестировать многие гены в различных экспериментальных условиях. Информация, полученная в результате экспериментального использования РНКи, может быть полезна для определения потенциальных терапевтических целей, разработки лекарств или других приложений.[8] РНК-интерференция - очень полезный инструмент исследования, позволяющий исследователям проводить большие генетические скрининги, чтобы определить цели для дальнейших исследований, связанных с конкретным путем, лекарственным средством или фенотипом.[9][10]

CRISPR

Другой способ подавления экзогенной ДНК, обнаруженный в прокариоты представляет собой механизм с участием локусов, называемый «кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками», или CRISPR.[11] Белки, называемые «CRISPR-ассоциированные гены» (cas-гены), кодируют клеточные механизмы, которые разрезают экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляют их в локус повтора CRISPR. Когда эта CRISPR-область ДНК экспрессируется клеткой, малые РНК, полученные из экзогенных вставок ДНК, служат в качестве матричной последовательности, которую другие Cas-белки используют для подавления этой же экзогенной последовательности. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве руководства, чтобы заглушить эти чужеродные ДНК, когда они присутствуют в клетке. Это своего рода приобретенный иммунитет, и этот процесс подобен механизму интерференции прокариотической РНК. Повторы CRISPR консервативны у многих видов и, как было продемонстрировано, могут использоваться в клетках человека,[12] бактерии[13] C. elegans,[14] данио,[15] и другие организмы для эффективного манипулирования геномом. Использование CRISPR в качестве универсального исследовательского инструмента можно проиллюстрировать.[16] многими исследованиями, использующими его для создания организмов с изменениями генома.

ТАЛЕНЫ

Другая технология, ставшая возможной благодаря манипуляциям с прокариотическим геномом, - это использование эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (ТАЛЕНЫ ) для нацеливания на определенные гены.[17] TALEN - это нуклеазы, которые имеют два важных функциональных компонента: домен связывания ДНК и домен расщепления ДНК. ДНК-связывающий домен представляет собой последовательность-специфичную эффекторную последовательность, подобную активатору транскрипции, тогда как ДНК-расщепляющий домен происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифическим. TALEN могут быть созданы для расщепления последовательности, определенной последовательностью эффекторной части конструкции, подобной активатору транскрипции. После создания TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в своей целевой последовательности и расщепляет определенный сайт. После расщепления целевой последовательности ДНК посредством TALEN клетка использует негомологичное соединение концов в качестве механизма репарации ДНК для коррекции расщепления. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может сделать кодируемый белок нефункциональным, поскольку этот механизм репарации вносит ошибки вставки или удаления в репарированном сайте.

Коммерциализация

До сих пор нокдаун-организмы с постоянными изменениями в их ДНК были созданы в основном для исследовательских целей. Также известен как нокдауны, эти организмы чаще всего используются для обратной генетики, особенно у таких видов, как мышей или же крысы для которых нелегко применить переходные технологии нокдауна.[3][18]

Есть несколько компаний, которые предлагают коммерческие услуги, связанные с лечением нокдауна генов.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ а б c Саммертон Дж. Э. (2007). «Сравнение морфолино, миРНК и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности». Актуальные темы медицинской химии. 7 (7): 651–60. Дои:10.2174/156802607780487740. PMID  17430206. S2CID  12241724.
  2. ^ Саммертон Дж. (Декабрь 1999 г.). «Морфолино-антисмысловые олигомеры: случай независимого от РНКазы Н структурного типа». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Структура и экспрессия гена. 1489 (1): 141–58. Дои:10.1016 / S0167-4781 (99) 00150-5. PMID  10807004.
  3. ^ а б Насевичюс А., Эккер СК (октябрь 2000 г.). «Эффективный целевой ген« нокдаун »у рыбок данио». Природа Генетика. 26 (2): 216–20. Дои:10.1038/79951. PMID  11017081. S2CID  21451111.
  4. ^ Валестедт, Клаас (февраль 1994 г.). «Антисмысловые олигонуклеотидные стратегии в нейрофармакологии». Тенденции Pharmacol Sci. 15 (2): 42–6. Дои:10.1016/0165-6147(94)90107-4. PMID  8165722.
  5. ^ Огонь А., Сюй С., Монтгомери М.К., Костас С.А., Драйвер С.Е., Мелло СС (февраль 1998 г.). «Мощное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК в Caenorhabditis elegans». Природа. 391 (6669): 806–11. Дои:10.1038/35888. PMID  9486653. S2CID  4355692.
  6. ^ Пратт А.Дж., Макрей И.Дж. (июль 2009 г.). «РНК-индуцированный комплекс подавления звука: универсальная машина подавления генов». Журнал биологической химии. 284 (27): 17897–901. Дои:10.1074 / jbc.R900012200. ЧВК  2709356. PMID  19342379.
  7. ^ Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J (ноябрь 2000 г.). «Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans путем систематической интерференции РНК». Природа. 408 (6810): 325–30. Дои:10.1038/35042517. PMID  11099033. S2CID  4373444.
  8. ^ Aagaard L, Росси JJ (март 2007 г.). «РНКи-терапия: принципы, перспективы и проблемы». Расширенные обзоры доставки лекарств. 59 (2–3): 75–86. Дои:10.1016 / j.addr.2007.03.005. ЧВК  1978219. PMID  17449137.
  9. ^ Камат Р.С., Арингер Дж. (Август 2003 г.). «Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans». Методы. 30 (4): 313–21. Дои:10.1016 / S1046-2023 (03) 00050-1. PMID  12828945.
  10. ^ Ghadakzadeh S, Mekhail M, Aoude A, Hamdy R, Tabrizian M (март 2016 г.). «Маленькие игроки правят в сложной игре: миРНК в регенерации костей». Журнал исследований костей и минералов. 31 (3): 475–87. Дои:10.1002 / jbmr.2816. PMID  26890411.
  11. ^ Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брар Г.А., Торрес С.Е., Стерн-Гиноссар Н., Брэндман О., Уайтхед Е.Х., Дудна Д.А., Лим В.А., Вайсман Д.С., Ци Л.С. (июль 2013 г.). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-управляемая регуляция транскрипции у эукариот». Клетка. 154 (2): 442–51. Дои:10.1016 / j.cell.2013.06.044. ЧВК  3770145. PMID  23849981.
  12. ^ Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж.Л., Моосбёрнер М., Яунг С.Дж., Church GM (ноябрь 2013 г.). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов под управлением РНК» (PDF). Методы природы. 10 (11): 1116–21. Дои:10.1038 / nmeth.2681. ЧВК  3844869. PMID  24076762.
  13. ^ Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «РНК-управляемое редактирование бактериальных геномов с использованием систем CRISPR-Cas». Природа Биотехнологии. 31 (3): 233–9. Дои:10.1038 / nbt.2508. ЧВК  3748948. PMID  23360965.
  14. ^ Чен С., Фенк Л.А., де Боно М. (ноябрь 2013 г.). «Эффективное редактирование генома Caenorhabditis elegans с помощью CRISPR-целевой гомологичной рекомбинации». Исследования нуклеиновых кислот. 41 (20): e193. Дои:10.1093 / nar / gkt805. ЧВК  3814388. PMID  24013562.
  15. ^ Хисано Ю., Ота С., Кавахара А. (январь 2014 г.). «Редактирование генома с использованием искусственных сайт-специфичных нуклеаз у рыбок данио». Развитие, рост и дифференциация. 56 (1): 26–33. Дои:10.1111 / dgd.12094. PMID  24117409.
  16. ^ Gennequin B, Otte DM, Zimmer A (ноябрь 2013 г.). «CRISPR / Cas-индуцированные двухцепочечные разрывы увеличивают частоту замен генов для гуманизации гена Cnr2 мыши». Сообщения о биохимических и биофизических исследованиях. 441 (4): 815–9. Дои:10.1016 / j.bbrc.2013.10.138. PMID  24211574.
  17. ^ Сун Н., Чжао Х (июль 2013 г.). «Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN): высокоэффективный и универсальный инструмент для редактирования генома». Биотехнологии и биоинженерия. 110 (7): 1811–21. Дои:10.1002 / бит. 24890. PMID  23508559. S2CID  6214542.
  18. ^ «Нокдаун клетки аденовируса». Sirion Biotech. Архивировано из оригинал 9 июля 2013 г.. Получено 17 апреля 2013.

внешняя ссылка