Потеря флуоресценции при фотообесцвечивании - Fluorescence loss in photobleaching

Снижение флуоресценции в определенной области (красный прямоугольник), рядом с обесцвеченной областью (кружок)

Потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP) это флуоресцентная микроскопия техника, используемая для изучения движения молекул внутри клеток и мембран. Клеточная мембрана обычно помечается флуоресцентным красителем для наблюдения. Определенная область этого помеченного участка затем несколько раз обесцвечивается с помощью луча конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. После каждого воображаемого сканирования снова происходит обесцвечивание. Это происходит несколько раз, чтобы все доступные флуорофоры отбеливаются, поскольку неотбеленные флуорофоры заменяются обесцвеченными флуорофорами, вызывая движение через клеточную мембрану. Затем измеряется количество флуоресценции этой области в течение определенного периода времени, чтобы определить результаты фотообесцвечивания клетки в целом.

Экспериментальная установка

Прежде чем произойдет фотообесцвечивание, в клетки необходимо ввести флуоресцентный белок, часто зеленый флуоресцентный белок (GFP), что позволит целевым белкам флуоресцировать и, следовательно, будет отслеживаться на протяжении всего процесса. Затем необходимо определить интересующую область. Эта начальная область интереса обычно содержит целую ячейку или несколько ячеек. В FLIP фотообесцвечивание происходит сразу за пределами интересующей области; поэтому также необходимо определить область фотообесцвечивания. Третий регион, где будут проводиться измерения, также должен быть определен. Перед фотообесцвечиванием необходимо выполнить ряд начальных сканирований для определения флуоресценции. Эти сканы будут служить в качестве контрольных, с которыми позже будут сравниваться фотообесцвеченные сканы. Тогда может произойти фотообесцвечивание. Между каждым импульсом отбеливания необходимо дать время для восстановления флуоресцентного материала. Также важно делать несколько сканирований интересующей области сразу после каждого импульса отбеливания для дальнейшего изучения.^[1] Затем изменение флуоресценции в интересующей области можно количественно оценить одним из трех способов. Чаще всего выбирают расположение, размер и количество интересующих областей на основе визуального осмотра наборов изображений. Два других, довольно новых, но более надежных подхода заключаются либо в обнаружении зон с различной подвижностью зонда на основе отдельного изображения, либо путем физического моделирования потери флуоресценции движущихся тел.^[2]

Потеря флуоресценции определяется подвижной фракцией или фракцией флуорофоров, способных восстанавливаться в фотообесцвеченной области флуоресцентно меченного белка. Неполная потеря флуоресценции указывает на то, что есть флуорофоры, которые не перемещаются и не перемещаются в обесцвеченную область. Это позволяет определить неподвижную фракцию или фракцию флуорофоров, неспособных восстанавливать в фотообесцвеченной области, флуоресцентно меченных белков. Неподвижность указывает на то, что есть белки, которые могут находиться в отсеках, закрытых от остальной части клетки, что предотвращает их воздействие при многократном фотообесцвечивании.^[3]

Приложения

Проверка непрерывности мембранных органелл

Основное использование FLIP - определение непрерывности мембранных органелл. Эта непрерывность или ее отсутствие определяется путем наблюдения за количеством флуоресценции в интересующей области. Если наблюдается полная потеря флуоресценции, это означает, что органеллы непрерывны. Однако, если происходит неполная потеря флуоресценции, то между органеллами нет непрерывности. Вместо этого эти органеллы разделены на части и поэтому закрыты для передачи любых фотообесцвеченных флуорофоров.^[3] Непрерывность аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума и ядра была подтверждена с помощью FLIP.

Обменный курс между ядром и цитоплазмой

Два других, менее часто используемых использования FLIP - это определение того, как белки перемещаются из цитоплазмы в ядро, а затем определение скорости, с которой это перемещение происходит. Чтобы определить, какие части задействованы и когда они задействованы в процессе челночного перемещения, наблюдаются непрерывные сканирования. Чем раньше часть цитоплазмы используется в процессе челночного перемещения, тем быстрее она испытывает полную потерю флуоресценции.^[4] Полученное изображение этого процесса должно представлять собой полностью фотообесцвеченную цитоплазму. Если клетка также участвует в ядерном экспорте из ядра в цитоплазму, фотообесцвечивание также будет происходить в ядре.

Скорость обмена между ядром и цитоплазмой также может быть определена на основе данных этого типа. В этих случаях область фотообесцвечивания находится внутри ядра. Если перемещение происходит в быстром темпе, уровни флуоресценции в ядерных компартментах будут быстро уменьшаться на всех снимаемых кадрах. Однако если переключение происходит медленно, уровни флуоресценции останутся неизменными или уменьшатся незначительно.^[4]

FLIP против FRAP

FLIP часто используется и тесно связан с Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Основное различие между этими двумя методами микроскопии заключается в том, что FRAP включает изучение способности клетки восстанавливаться после одного события фотообесцвечивания, тогда как FLIP включает изучение того, как потеря флуоресценции распространяется по клетке после нескольких событий фотообесцвечивания. Это различие в назначении также приводит к различию в том, какие части клетки наблюдаются. В FRAP область, которая фактически подвергается фотообесцвечиванию, является областью интереса. И наоборот, в FLIP интересующая область находится за пределами области, которая подвергается фотообесцвечиванию. Еще одно важное отличие состоит в том, что в FRAP существует одно событие фотообесцвечивания и период восстановления, чтобы наблюдать, насколько хорошо флуорофоры возвращаются на обесцвеченный участок. Однако в FLIP происходит несколько событий фотообесцвечивания, чтобы предотвратить возвращение небеленых флуорофоров в область обесцвечивания. Как и FLIP, FRAP используется для изучения непрерывности мембранных органелл. FLIP и FRAP часто используются вместе для определения подвижности белков, меченных GFP.^[3] FLIP также можно использовать для измерения молекулярного переноса между областями клетки независимо от скорости движения. Это позволяет проводить более полный анализ перемещения белков внутри клетки. Это отличается от FRAP, который в первую очередь полезен для определения подвижности белков в областях, локальных только для фотообесцвечивания.^[5]

Возможные осложнения

Как FLIP, так и FRAP имеют несколько осложнений. Поскольку обе формы микроскопии исследуют живые клетки, всегда существует вероятность того, что клетки будут двигаться, что приведет к ложным результатам. Лучший способ избежать этого - использовать алгоритм выравнивания, который компенсирует любое перемещение и устраняет большую часть ошибки, связанной с перемещением. В этих экспериментах также важно иметь контрольную группу для корректировки результатов и корректировки кривой восстановления для общей потери флуоресценции.^[3] Еще один способ минимизировать ошибку - сохранить фотообесцвечивание в одной области или области. Это ограничение будет служить контролем и ограничивать потерю флуоресценции из-за фото-повреждения по сравнению с потерей флуоресценции из-за фотообесцвечивания.^[3]