Φ29 ДНК-полимераза - Φ29 DNA polymerase

ДНК-полимераза
Идентификаторы
Организм	Bacillus phage phi29
Символ	2
UniProt	P03680
Ищи Структуры Швейцарская модель Домены ИнтерПро

ДНК-полимераза типа B, органелларная и вирусная, phi29-подобная
Идентификаторы
Символ	ДНК_пол_Б_2
Pfam	PF03175
ИнтерПро	IPR014416
SCOP2	2py5 / Объем / СУПФАМ
Доступные белковые структуры: Pfam   структуры / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum резюме структуры

Φ29 ДНК-полимераза это фермент из бактериофаг Φ29. Его все чаще используют в молекулярная биология за многократная амплификация ДНК смещения процедур и имеет ряд функций, которые делают его особенно подходящим для этого приложения.

Φ29 репликация ДНК

Φ29 - бактериофаг Bacillus subtilis с секвенированным, линейным геномом ДНК из 19 285 пар оснований.^[1] Каждый 5'-конец ковалентно связан с концевым белком, который важен в процессе репликации. Был предложен симметричный способ репликации, при котором инициация, примированная белком, происходит неодновременно с любого конца хромосомы; это включает в себя два начала репликации и два различных мономера полимеразы. Синтез является непрерывным и включает механизм смещения цепи. Это было продемонстрировано способностью фермента продолжать копировать однократно примированный кольцевой геном фага M13 более чем в десять раз в одной цепи (более 70 kb в одной цепи).^[2]Эксперименты in vitro показали, что репликация Φ29 может продолжаться до завершения при потребностях в фаговом белке только полимеразы и концевого белка.^[2]Полимераза катализирует образование комплекса инициации между концевым белком и концами хромосомы на остатке аденина. Отсюда может происходить непрерывный синтез.

Полимераза

Полимераза - это мономерный белок с двумя различными функциональными доменами. Ориентированный на сайт мутагенез эксперименты поддерживают предложение что этот белок демонстрирует структурное и функциональное сходство с Кленовский фрагмент из кишечная палочка Фермент полимераза I;^[3] он включает C-концевой домен полимеразы и пространственно разделенный N-концевой домен с 3'-5' экзонуклеаза Мероприятия.

Выделенный фермент не имеет собственных геликаза активности, но может выполнять эквивалентную функцию за счет прочной привязки к одноцепочечная ДНК, особенно предпочтительнее двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Это свойство этого фермента позволяет успешно применять его для Многократное усиление смещения. Фермент способствует «разветвлению» двухцепочечной ДНК.^[2] Дезоксирибонуклеозид трифосфат расщепление, которое происходит как часть процесса полимеризации, вероятно, обеспечивает энергию, необходимую для этого механизма разматывания.^[4] Непрерывный характер синтеза цепей (по сравнению с асимметричным синтезом, наблюдаемым у других организмов), вероятно, способствует этой повышенной процессивности. экзонуклеаза домен был продемонстрирован путем предпочтительного удаления несовпадающего нуклеотида из 3 'конечная точка вновь синтезированной нити.^[5] Экзонуклеазная активность фермента, как и его полимеризационная активность, является высокопроизводительной и может разрушать одноцепочечные олигонуклеотиды без диссоциации. Сотрудничество или «деликатное соревнование» между этими двумя функциональными областями необходимо для обеспечения точного удлинения с оптимальной скоростью. Экзонуклеазная активность фермента снижает его способность к полимеризации; инактивация экзонуклеазной активности посредством сайт-направленного мутагенеза означала, что для достижения тех же скоростей удлинения праймера, которые наблюдаются в ДНК, требуется 350-кратное снижение концентрации dNTP. дикого типа фермент.^[5]

Амплификация всего генома

Фермент полимеразы Ф29 уже используется в многократное усиление смещения (MDA) процедуры (в том числе в ряде коммерческих наборов), посредством которых фрагменты длиной в десятки килобазей могут быть получены из неспецифических гексамерных праймеров, отжигаемых с интервалами вдоль генома. Фермент обладает многими желательными свойствами, которые делают его подходящим для амплификация всего генома (WGA) этим методом.^[6]

• Высокая процессивность.^[2]
• Корректорная деятельность.^[5] Считается, что она на 1 или 2 порядка менее подвержена ошибкам, чем полимераза Taq.^[7]
• Создает большие фрагменты размером более 10 КБ.
• Производит больше ДНК, чем методы, основанные на ПЦР, примерно на порядок.^[8]
• Требуется минимальное количество шаблона; Достаточно 10 нг.
• Новый механизм репликации; многонитевое смещение амплификации.
  • Случайный грунтовки (гексамеры), не нужно конструировать специфические праймеры / целевые области.
  • Нет необходимости в термоциклировании.
• Хороший охват и меньшая систематическая ошибка амплификации по сравнению с подходами на основе ПЦР. Есть предположение, что это наименее предвзятый из используемых методов WGA.^[8]

Рекомендации

1. Vlcek C, Paces V (1986). «Нуклеотидная последовательность поздней области фага Φ29 Bacillus завершает последовательность длиной 19 285 п.н. генома Φ29. Сравнение с гомологичной последовательностью фага PZA». Ген. 46 (2–3): 215–25. Дои:10.1016/0378-1119(86)90406-3. PMID  3803926.
2. Бланко Л., Бернад А., Ласаро Дж. М., Мартин Дж., Гармендиа С., Салас М. (май 1989 г.). «Высокоэффективный синтез ДНК ДНК-полимеразой фага Ф29. Симметричный режим репликации ДНК». J. Biol. Chem. 264 (15): 8935–40. PMID  2498321.
3. Бернад А., Бланко Л., Салас М. (сентябрь 1990 г.). «Сайт-направленный мутагенез аминокислотного мотива YCDTDS ДНК-полимеразы phi 29». Ген. 94 (1): 45–51. Дои:10.1016/0378-1119(90)90466-5. PMID  2121621.
4. Альбертс Б., Стернланц Р. (октябрь 1977 г.). «Недавнее волнение по поводу проблемы репликации ДНК». Природа. 269 (5630): 655–61. Дои:10.1038 / 269655a0. PMID  201853.
5. Гармендия С., Бернад А., Эстебан Дж. А., Бланко Л., Салас М. (февраль 1992 г.). "ДНК-полимераза бактериофага phi 29, корректирующий фермент". J. Biol. Chem. 267 (4): 2594–9. PMID  1733957.
6. Алсмади О, Алкаял Ф, Монис Д., Мейер Б.Ф. (2009). «Специфическая и полная амплификация генома человека с улучшенным выходом, достигаемым с помощью ДНК-полимеразы phi29 и нового праймера при повышенной температуре». BMC Res Примечания. 2: 48. Дои:10.1186/1756-0500-2-48. ЧВК  2663774. PMID  19309528.
7. Пью Т.Дж., Делани А.Д., Фарноуд Н. и др. (Август 2008 г.). «Влияние полногеномной амплификации на анализ вариантов числа копий». Нуклеиновые кислоты Res. 36 (13): e80. Дои:10.1093 / nar / gkn378. ЧВК  2490749. PMID  18559357.
8. Пинар Р., де Винтер А., Саркис Г. Дж. И др. (2006). «Оценка систематической ошибки, вызванной амплификацией всего генома, с помощью высокопроизводительного параллельного секвенирования всего генома». BMC Genomics. 7: 216. Дои:10.1186/1471-2164-7-216. ЧВК  1560136. PMID  16928277.

дальнейшее чтение

• Линк Л., Реш-Генгер Ю. (2010). «Идентификация эффективных флуорофоров для прямого мечения ДНК посредством амплификации катящегося круга (RCA) полимеразы φ29». Eur J Med Chem. 45 (12): 5561–6. Дои:10.1016 / j.ejmech.2010.09.005. PMID  20926164.
• де Вега М., Ласаро Дж. М., Менсия М., Бланко Л., Салас М. (2010). «Повышение эффективности амплификации ДНК-полимеразы φ29 за счет слияния ДНК-связывающих мотивов». Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38): 16506–11. Дои:10.1073 / pnas.1011428107. ЧВК  2944734. PMID  20823261.
• Перес-Арнаис П., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2010). «Активный центр ДНК-полимеразы phi29: роль остатка Val250 в качестве лиганда комплекса металл-dNTP и в инициации, примированной белком». Дж Мол Биол. 395 (2): 223–33. Дои:10.1016 / j.jmb.2009.10.061. PMID  19883660.
• Перес-Арнаис П., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2009). «Функциональное значение остатка Tyr148 ДНК-полимеразы бактериофага phi29 в стабилизации конца праймера в активном сайте экзонуклеазы 3'-5 '». Дж Мол Биол. 391 (5): 797–807. Дои:10.1016 / j.jmb.2009.06.068. PMID  19576228.
• Джон Р, Мюллер Х, Ректор А, ван Ранст М, Стивенс Х (2009). «Круговая амплификация вирусных ДНК геномов с использованием полимеразы phi29». Тенденции Microbiol. 17 (5): 205–11. Дои:10.1016 / j.tim.2009.02.004. PMID  19375325.
• Лагунавичюс А., Меркиене Э., Киверите З., Саванявичюте А., Зимбайте-Рускулиене В., Радзвилавичюс Т., Янулайтис А. (2009). «Новое применение ДНК-полимеразы Phi29: обнаружение и анализ РНК in vitro и in situ с помощью RCA, примированного целевой РНК». РНК. 15 (5): 765–71. Дои:10.1261 / rna.1279909. ЧВК  2673074. PMID  19244362.
• Родригес И., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2009). "Участие движения субдомена TPR2 в активности ДНК-полимеразы phi29". Нуклеиновые кислоты Res. 37 (1): 193–203. Дои:10.1093 / nar / gkn928. ЧВК  2615600. PMID  19033368.
• Саху С., Лабин Т.Х., Рейф Дж. Х. (2008). «Устройство для нанотранспорта ДНК на основе полимеразы phi29». Nano Lett. 8 (11): 3870–8. CiteSeerX  10.1.1.151.6316. Дои:10.1021 / nl802294d. PMID  18939810.
• Сюй Ю., Гао С., Бруно Дж. Ф., Люфт Б. Дж., Данн Дж. Дж. (2008). «Быстрое обнаружение и идентификация ДНК патогена с помощью ДНК-полимеразы Phi29». Biochem. Биофиз. Res. Сообщество. 375 (4): 522–5. Дои:10.1016 / j.bbrc.2008.08.082. ЧВК  2900840. PMID  18755142.
• Кумар Г, Гарнова Э, Рейгин М, Видали А (2008). «Улучшенная многократная амплификация смещения с ДНК-полимеразой phi29 для генотипирования единичных клеток человека». Биотехнологии. 44 (7): 879–90. Дои:10.2144/000112755. PMID  18533898.
• Салас М., Бланко Л., Ласаро Дж. М., де Вега М. (2008). «ДНК-полимераза бактериофага phi29». IUBMB Life. 60 (1): 82–5. Дои:10.1002 / iub.19. PMID  18379997.
• Силандер К., Саарела Дж. (2008). Амплификация всего генома с помощью ДНК-полимеразы Phi29 для генетического или геномного анализа образцов с низким выходом ДНК. Методы Мол Биол. Методы молекулярной биологии. 439. С. 1–18. Дои:10.1007/978-1-59745-188-8_1. ISBN  978-1-58829-871-3. PMID  18370092.
• Лагунавичюс А., Киверите З., Зимбаите-Рускулиене В., Радзвилавичюс Т., Янулайтис А. (2008). «Двойственность полинуклеотидных субстратов для ДНК-полимеразы Phi29: 3 '-> 5' РНКазная активность фермента». РНК. 14 (3): 503–13. Дои:10.1261 / rna.622108. ЧВК  2248250. PMID  18230765.
• Перес-Арнаис П., Лонгас Э., Вильяр Л., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2007). «Вовлечение ДНК-полимеразы фага phi29 и концевых белковых субдоменов в придание специфичности во время инициации репликации ДНК, примированной белком». Нуклеиновые кислоты Res. 35 (21): 7061–73. Дои:10.1093 / нар / гкм749. ЧВК  2175359. PMID  17913744.
• Берман А.Дж., Камтекар С., Гудман Дж. Л., Ласаро Дж. М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейтц Т. А. (2007). «Структуры ДНК-полимеразы phi29 в комплексе с субстратом: механизм транслокации в полимеразах B-семейства». EMBO J. 26 (14): 3494–505. Дои:10.1038 / sj.emboj.7601780. ЧВК  1933411. PMID  17611604.
• Книрим Д., Маисс Э (2007). «Применение ДНК-полимеразы Phi29 для идентификации и инокуляции полноразмерных клонов вируса курчавости листьев томата Таиланда и вируса курчания листьев табака Таиланда» Arch Virol. 152 (5): 941–54. Дои:10.1007 / s00705-006-0914-9. PMID  17226067.
• Овор Б.Е., Шеперд Д.Н., Тейлор Н.Дж., Эдема Р., Монджейн А.Л., Томсон Дж. А., Мартин Д.П., Варсани А. (2007). «Успешное применение технологии FTA Classic Card и использование ДНК-полимеразы бактериофага phi29 для крупномасштабного полевого отбора проб и клонирования полных геномов вируса полосатости кукурузы». J Virol Методы. 140 (1–2): 100–5. Дои:10.1016 / j.jviromet.2006.11.004. PMID  17174409.
• Сато М., Оцука М., Оми Ю. (2004). «Повторная GenomiPhi, амплификация по вращающемуся кругу на основе ДНК-полимеразы phi29, полезна для генерации больших количеств плазмидной ДНК». Нуклеиновые кислоты Symp Ser (Oxf). 48 (48): 147–8. Дои:10.1093 / nass / 48.1.147. PMID  17150521.
• Перес-Арнаис П., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2006). «Вовлечение субдомена большого пальца ДНК-полимеразы phi29 в правильную координацию синтеза и деградации во время репликации ДНК». Нуклеиновые кислоты Res. 34 (10): 3107–15. Дои:10.1093 / нар / gkl402. ЧВК  1475753. PMID  16757576.
• Камтекар С., Берман А.Дж., Ван Дж., Ласаро Дж. М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейтц Т. А. (2006). «ДНК-полимераза phi29: структура белок-праймер предлагает модель перехода от инициации к элонгации». EMBO J. 25 (6): 1335–43. Дои:10.1038 / sj.emboj.7601027. ЧВК  1422159. PMID  16511564.
• Hutchison CA, Smith HO, Pfannkoch C, Venter JC (2005). «Бесклеточное клонирование с использованием ДНК-полимеразы phi29». Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (48): 17332–6. Дои:10.1073 / pnas.0508809102. ЧВК  1283157. PMID  16286637.
• Сато М., Оцука М., Оми Ю. (2005). «Полезность повторного GenomiPhi, набора для амплификации на основе ДНК-полимеразы phi29, для создания больших количеств плазмидной ДНК». Biomol Eng. 22 (4): 129–32. Дои:10.1016 / j.bioeng.2005.05.001. PMID  16023891.
• Родригес И., Ласаро Дж. М., Бланко Л., Камтекар С., Берман А. Дж., Ван Дж., Стейтц Т. А., Салас М., де Вега М. (2005). «Специфический субдомен в ДНК-полимеразе phi29 обеспечивает как процессивность, так и способность замещения цепи». Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (18): 6407–12. Дои:10.1073 / pnas.0500597102. ЧВК  1088371. PMID  15845765.
• Трунигер В., Боннин А., Ласаро Дж. М., де Вега М., Салас М. (2005). «Участие« линкерной »области между экзонуклеазой и доменами полимеризации ДНК-полимеразы phi29 в связывании ДНК и TP». Ген. 348: 89–99. Дои:10.1016 / j.gene.2004.12.041. PMID  15777661.
• Уметани Н, де Маат М.Ф., Мори Т., Такеучи Х., Хун Д.С. (2005). «Синтез универсальной неметилированной контрольной ДНК путем вложенной амплификации всего генома с ДНК-полимеразой phi29». Biochem. Биофиз. Res. Сообщество. 329 (1): 219–23. Дои:10.1016 / j.bbrc.2005.01.088. PMID  15721296.
• Гадкар V, Риллиг MC (2005). «Применение опосредованной ДНК-полимеразой Phi29 амплификации всего генома на отдельных спорах грибов арбускулярной микоризной (AM)». FEMS Microbiol Lett. 242 (1): 65–71. Дои:10.1016 / j.femsle.2004.10.041. PMID  15621421.
• Камтекар С., Берман А.Дж., Ван Дж., Ласаро Дж. М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейтц Т. А. (2004). «Понимание смещения цепи и процессивности из кристаллической структуры белковой ДНК-полимеразы бактериофага phi29». Mol Cell. 16 (4): 609–18. Дои:10.1016 / j.molcel.2004.10.019. PMID  15546620.
• Адачи Э, Шимамура К., Вакамацу С., Кодама Х (2004). «Амплификация геномной ДНК растений с помощью ДНК-полимеразы Phi29 для использования в физическом картировании гиперметилированной области генома». Rep клетки растений. 23 (3): 144–7. Дои:10.1007 / s00299-004-0806-y. PMID  15168072.
• Родригес И., Ласаро Дж. М., Салас М., Де Вега М. (2004). «Взаимодействие ДНК-полимеразы phi29 с концевым белком. Вовлечение остатков, специфически консервативных среди ДНК-полимераз, примированных белком». Дж Мол Биол. 337 (4): 829–41. Дои:10.1016 / j.jmb.2004.02.018. PMID  15033354.
• Иноуэ-Нагата АК, Альбукерке Л.С., Роча В.Б., Нагата Т. (2004). «Простой метод клонирования полного генома бегомовируса с использованием ДНК-полимеразы бактериофага phi29». J Virol Методы. 116 (2): 209–11. Дои:10.1016 / j.jviromet.2003.11.015. PMID  14738990.
• Трунигер В., Ласаро Дж. М., Салас М. (2004). «Функция С-конца ДНК-полимеразы phi29 в связывании ДНК и концевого белка». Нуклеиновые кислоты Res. 32 (1): 361–70. Дои:10.1093 / нар / гх184. ЧВК  373294. PMID  14729920.
• Трунигер В., Ласаро Дж. М., Салас М. (2004). «Два положительно заряженных остатка ДНК-полимеразы phi29, консервативные в ДНК-полимеразах, примированных белками, участвуют в стабилизации поступающего нуклеотида». Дж Мол Биол. 335 (2): 481–94. Дои:10.1016 / j.jmb.2003.10.024. PMID  14672657.
• Родригес И., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2003). «phi29 ДНК-полимеразный остаток Phe128 высококонсервативного (S / T) Lx (2) h мотива необходим для стабильного и функционального взаимодействия с концевым белком». Дж Мол Биол. 325 (1): 85–97. Дои:10.1016 / S0022-2836 (02) 01130-0. PMID  12473453.
• Нельсон Дж. Р., Цай Ю. К., Гислер Т. Л., Фарчаус Дж. В., Сундарам СТ, Ортиз-Ривера М., Хоста Л. П., Хьюитт П. Л., Мамоне Дж. А., Паланиаппан К., Фуллер К. В. (2002). "TempliPhi, phi29 ДНК-полимераза на основе амплификации шаблонов по вращающемуся кругу для секвенирования ДНК". Биотехнологии. Дополнение: 44–7. PMID  12083397.
• Трунигер В., Ласаро Дж. М., Бланко Л., Салас М. (2002). «Высококонсервативный остаток лизина в ДНК-полимеразе phi29 важен для правильного связывания шаблонного нуклеотида во время инициации репликации ДНК phi29». Дж Мол Биол. 318 (1): 83–96. Дои:10.1016 / S0022-2836 (02) 00022-0. PMID  12054770.
• Трунигер В., Ласаро Дж. М., Эстебан Ф. Дж., Бланко Л., Салас М. (2002). «Положительно заряженный остаток ДНК-полимеразы phi29, высококонсервативный в ДНК-полимеразах из семейств A и B, участвует в связывании поступающего нуклеотида». Нуклеиновые кислоты Res. 30 (7): 1483–92. Дои:10.1093 / nar / 30.7.1483. ЧВК  101840. PMID  11917008.
• Айзенбрандт Р., Ласаро Дж. М., Салас М., де Вега М. (2002). «Остатки ДНК-полимеразы Phi29 Tyr59, His61 и Phe69 высококонсервативного мотива ExoII необходимы для взаимодействия с концевым белком». Нуклеиновые кислоты Res. 30 (6): 1379–86. Дои:10.1093 / nar / 30.6.1379. ЧВК  101362. PMID  11884636.
• Элиас-Арнанс М, Салас М (1999). «Разрешение лобовых столкновений между аппаратом транскрипции и ДНК-полимеразой бактериофага phi29 зависит от транслокации РНК-полимеразы». EMBO J. 18 (20): 5675–82. Дои:10.1093 / emboj / 18.20.5675. ЧВК  1171634. PMID  10523310.
• де Вега М., Бланко Л., Салас М. (1999). «Процессивная корректура и пространственные отношения между активными центрами полимеразы и экзонуклеазы ДНК-полимеразы бактериофага phi29». Дж Мол Биол. 292 (1): 39–51. Дои:10.1006 / jmbi.1999.3052. PMID  10493855.
• Боннин А., Ласаро Дж. М., Бланко Л., Салас М. (1999). «Единственный тирозин предотвращает встраивание рибонуклеотидов в ДНК-полимеразу phi29 эукариотического типа». Дж Мол Биол. 290 (1): 241–51. Дои:10.1006 / jmbi.1999.2900. PMID  10388570.
• Трунигер В., Бланко Л., Салас М. (1999). «Роль мотива« YxGG / A »ДНК-полимеразы Phi29 в репликации, примированной белком». Дж Мол Биол. 286 (1): 57–69. Дои:10.1006 / jmbi.1998.2477. PMID  9931249.
• де Вега М., Бланко Л., Салас М. (1998). «остаток ДНК-полимеразы phi29 Ser122, одноцепочечный ДНК-лиганд для 3'-5'-экзонуклеолиза, необходим для взаимодействия с концевым белком». J Biol Chem. 273 (44): 28966–77. Дои:10.1074 / jbc.273.44.28966. PMID  9786901.
• Сатурно Дж., Ласаро Дж. М., Бланко Л., Салас М. (1998). «Роль первого аспартатного остатка в мотиве« YxDTDS »ДНК-полимеразы phi29 в качестве металлического лиганда во время синтеза ДНК как с TP, так и с ДНК». Дж Мол Биол. 283 (3): 633–42. Дои:10.1006 / jmbi.1998.2121. PMID  9784372.
• Мурти В., Мейер В. Дж., Бланко Л., Салас М. (1998). «Переключение матрицы ДНК-полимеразы в определенных сайтах генома phi29 вызывает накопление in vivo субгеномных молекул ДНК phi29». Мол Микробиол. 29 (3): 787–98. Дои:10.1046 / j.1365-2958.1998.00972.x. PMID  9723918.
• Иллана Б., Забаллос А., Бланко Л., Салас М. (1998). «Последовательность RGD в концевом белке фага phi29 необходима для взаимодействия с ДНК-полимеразой phi29». Вирусология. 248 (1): 12–9. Дои:10.1006 / viro.1998.9276. PMID  9705251.
• де Вега М., Ласаро Дж. М., Салас М., Бланко Л. (1998). «Мутационный анализ остатков ДНК-полимеразы phi29, действующих как лиганды оцДНК для 3'-5'-экзонуклеолиза». Дж Мол Биол. 279 (4): 807–22. Дои:10.1006 / jmbi.1998.1805. PMID  9642062.
• Бланко Л., Салас М. (1996). «Связь структуры с функцией ДНК-полимеразы phi29». J Biol Chem. 271 (15): 8509–12. Дои:10.1074 / jbc.271.15.8509. PMID  8621470.
• де Вега М., Лазаро Дж. М., Салас М., Бланко Л. (1996). «Стабилизация праймер-конца в активном сайте экзонуклеазы 3'-5 'ДНК-полимеразы phi29. Вовлечение двух высококонсервативных аминокислотных остатков в проверочных ДНК-полимеразах». EMBO J. 15 (5): 1182–92. Дои:10.1002 / j.1460-2075.1996.tb00457.x. ЧВК  450017. PMID  8605889.