Карта ограничений - Restriction map

Для использования в других целях см. Ограничение (значения).

А карта ограничений это карта известных сайты ограничения в последовательности ДНК. Отображение ограничений требует использования рестрикционные ферменты. В молекулярная биология рестрикционные карты используются в качестве ссылки для создания плазмид или других относительно коротких фрагментов ДНК, а иногда и для более длинных геномных ДНК. Есть и другие способы картирования особенностей ДНК для более длинных молекул ДНК, например, картирование с помощью трансдукция.[1]

Один из подходов к построению рестрикционной карты молекулы ДНК заключается в секвенировании всей молекулы и прогоне последовательности с помощью компьютерной программы, которая найдет сайты узнавания, которые присутствуют для каждого известного рестрикционного фермента.

До того, как секвенирование было автоматизировано, было бы непомерно дорого последовательность целая цепь ДНК. Чтобы найти относительные положения рестрикционных сайтов на плазмиде, используется метод, включающий одинарный и двойной рестрикционный гидролиз. На основании размеров полученных фрагментов ДНК можно сделать вывод о положениях сайтов. Рестрикционное картирование является очень полезным методом при использовании для определения ориентации вставки в векторе клонирования путем картирования положения смещенного от центра сайта рестрикции во вставке.[2]

Метод

Для экспериментальной процедуры сначала требуется аликвота очищенной плазмидной ДНК (см. Приложение) для каждого анализа. Затем проводится пищеварение с каждым выбранным ферментом (ами). Полученные образцы впоследствии запускаются на электрофорез гель, обычно на агароза гель.

Первым шагом после завершения электрофореза является сложение размеров фрагментов на каждой дорожке. Сумма отдельных фрагментов должна равняться размеру исходного фрагмента, и в сумме фрагменты каждого дайджеста должны иметь одинаковый размер друг с другом. Если размеры фрагментов не складываются должным образом, вероятны две проблемы. В одном случае некоторые из более мелких фрагментов могли соскочить с конца геля. Это часто происходит, если гель используется слишком долго. Второй возможный источник ошибки заключается в том, что гель не был достаточно плотным и, следовательно, не мог разделить фрагменты близкого размера. Это приводит к отсутствию разделения близких по размеру фрагментов. Если все расщепления производят фрагменты, которые складываются, можно сделать вывод о положении сайтов REN (эндонуклеазы рестрикции), поместив их в такие места на исходном фрагменте ДНК, которые удовлетворяли бы размерам фрагментов, произведенных всеми тремя перевариваниями.

Смотрите также рестрикционные ферменты для получения более подробной информации об используемых в этой методике ферментах.

Пример

Например, представлено наиболее распространенное применение ограничительного отображения: Определение ориентации клонированной вставки. Этот метод требует, чтобы уже были доступны рестрикционные карты вектора клонирования и вставки.

Если вам известен сайт рестрикции, расположенный ближе к одному концу вставки, вы можете определить его ориентацию, наблюдая за размером фрагментов в геле. Часто ориентация вставок важна, и этот метод используется для проверки правильности ориентации.

В этом примере будет найдена ориентация вставки, клонированной с помощью EcoRI.

Дайджесты

Полученные фрагменты: приблизительные размеры

  • 1: 3 кб, 5 кб
  • 2: 2 кб, 6 кб
  • 3: 2 кб, 1 кб, 5 кб,

Гипотетический сайт множественного клонирования вектора

5 '----- HindIII-EcoRI ---- 3'

Обсуждение

Обработка EcoRI вырезает вставку, давая фрагменты размером 3 т.п.н. и 5 т.п.н. Это размеры вставки и векторной магистрали соответственно. Это ожидаемо, поскольку размер как вставки, так и вектора известен заранее. Наличие вставки подтверждено.

Известный сайт HindIII находится вне центра вставки размером 3 т.п.н. Он находится на расстоянии 2 КБ от одного конца (конец A) и на 1 КБ от другого конца (конец B). Обработка HindIII вашего клона дает фрагменты размером 2 т.п.н. и 6 т.п.н. Фрагмент 2 т.п.н. является исключительно последовательностью вставки, а фрагмент 6 т.п.н. представляет собой последовательность вставки размером 1 т.п.н., присоединенную к 5 т.п.н. последовательности вектора. Это означает, что вставка была клонирована в ориентации от А к В, в отличие от ориентации от В до А, что даст фрагменты размером 7 т.п.н. и 1 т.п.н.

Результирующая карта

Результирующая карта

Связанные методы

Быстрая денатурация и ренатурация неочищенного препарата ДНК путем щелочного лизиса клеток и последующей нейтрализации

В этом методе клетки лизируются в щелочных условиях. ДНК в смеси денатурируется (цепи разделяются) за счет разрыва водородных связей между двумя цепями. Большая геномная ДНК может запутываться и оставаться денатурированной при снижении pH во время нейтрализации. Другими словами, нити возвращаются вместе неупорядоченным образом, случайным образом спариваясь по основанию. Циркуляр сверхспиральные плазмиды ' пряди останутся относительно близко выровненными и будут правильно ренатурировать. Следовательно, геномная ДНК будет образовывать нерастворимый агрегат и суперскрученный плазмиды останутся в растворе. За этим может последовать фенольная экстракция для удаления белков и других молекул. Затем ДНК можно подвергнуть осаждение этанолом сконцентрировать образец.

Смотрите также

  • Вектор НТИ, программное обеспечение для биоинформатики, используемое, помимо прочего, для прогнозирования сайтов рестрикции в ДНК-векторе.
  • RFLP, метод, используемый, среди прочего, для дифференциации очень похожих геномов

Рекомендации

  1. ^ Битнер, Р; Куэмпель, Питер (февраль 1982 г.). «Картирование трансдукции P1 локуса trg в rac + и rac штаммах Escherichia coli K-12» (PDF). Журнал бактериологии. 149 (2): 529–533. Дои:10.1128 / JB.149.2.529-533.1982.
  2. ^ Дейл, Дж; фон Шанц, М; Гринспен, Д. (2003). От генов к геномам. Западный Сассекс: John Wiley & Sons Ltd.