Рекомбинантные антитела - Recombinant antibodies

Рекомбинантные антитела находятся антитело фрагменты, полученные с использованием рекомбинантных антител кодирующие гены.[1] В основном они состоят из тяжелый и легкая цепь из переменная область из иммуноглобулин. Рекомбинантные антитела имеют множество преимуществ как в медицинских, так и в исследовательских целях, что делает их популярным объектом исследований и новых разработок против конкретных мишеней. Наиболее часто используемая форма - это одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который показал наиболее многообещающие черты, которые можно использовать в медицине и исследованиях человека.[2] В отличие от моноклональные антитела произведено гибридомная технология, которые со временем могут потерять способность продуцировать желаемое антитело или антитело может претерпевать нежелательные изменения, которые влияют на его функциональность, рекомбинантные антитела, продуцируемые в фаговый дисплей поддерживать высокий стандарт специфичность и низкий иммуногенность.[3][4]

Структура и характеристика

Форматы

Существует несколько известных форматов рекомбинантных антител, которые обычно производятся. Эти Fab рекомбинантные антитела, scFv и диатела.[4][5][3] Каждый из форматов имеет несколько разный потенциал в применении и может использоваться в различных областях исследований, а также в медицине человека и животных.[6] Другая исследуемая возможность - это разработка антиидиотипический антитела. Антиидиотипические антитела связываются с паратоп другого специфического антитела. Следовательно, его можно использовать для измерения наличия антител и лекарственной нагрузки у пациентов. сыворотка.[7] На основе их специфичности связывания можно выделить 3 типа антиидиотипических антител, которые частично перекрываются с ранее упомянутыми форматами: классические, группа, включающая антитела к фрагментам Fab, антитела, связывающиеся с идиотоп вне участка связывания лекарственного средства и антител, которые связываются только с уже собранным комплексом лекарственного средства, связанного с мишенью.[7] Чаще всего используются scFv, фрагменты Fab и биспецифические антитела.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)

scFv - это наименьший из форматов рекомбинантных антител, который способен к антиген привязка.[8] У них есть молекулярный вес примерно 27 кДа.[9] Они образованы легкой и тяжелой цепями вариабельной области иммуноглобулина. Две цепи связаны гибкой пептид компоновщик.[2] Гибкий пептидный линкер обычно состоит из коротких последовательность репетиция. Последовательность состоит из четырех глицины и серин [5] и служит для стабилизации фрагмента.[8][10] Функциональность может быть усилена химическими модификациями на конкретном участке, добавлением пептид-метка или по слияние с геном для получения бифункциональных рекомбинантных антител.[9] Важно установить связывающую активность, чтобы гарантировать хорошую функциональность продукта. Чтобы определить связывающую активность, ELISA обычно выполняется анализ.[11]

Fab фрагменты

Структурно Fab-фрагменты состоят из двух наборов переменных и постоянных компонентов, которые образуют две полипептидные цепи. Вместе они образуют стабильную структуру.[5] Как член антиидиотипических антител, рекомбинантные антитела Fab-фрагмента связываются непосредственно с паратопом целевого антитела. Это означает, что они конкурируют с лекарством за сайт связывания и обладают ингибирующей функцией. Антитела к Fab-фрагменту можно использовать для обнаружения несвязанных или свободных лекарств в сыворотке.[7] Fab-антитела также использовались, чтобы избежать побочные эффекты вызвано неспецифическим связыванием Fc часть антитела, которая отсутствует в Fab-фрагменте.[5] В случае если IgG иммуноглобулин был более подходящим для лечения или какого-либо другого конкретного применения, также были проведены эксперименты, в которых рекомбинантные фрагменты Fab были преобразованы в форму рекомбинантного IgG. Эта возможность еще больше расширяет круг потенциальных целевых структур.[12]

Биспецифические рекомбинантные антитела

Вдоль scFv и Fab-фрагментов, диател или биспецифические рекомбинантные антитела являются третьим основным форматом.[5] Биспецифические антитела сочетают в себе две разные антигенсвязывающие специфичности в одной молекуле.[10] Биспецифические антитела используются для сшивка молекулы-мишени с двумя разными клетками и опосредуют прямые цитотоксичность.[13][14]

Производство и разработка

Производство рекомбинантных антител

Производство рекомбинантных антител происходит в основном с аналогичным рабочим процессом. Он состоит из определения последовательности желаемого продукта с последующим уточнением кодон, затем синтез гена и создание конструкции. Как только конструкция доставляется в лабораторию, создаются экспрессионные конструкции, которые затем переносятся в лабораторию. культура клеток в процессе называется трансфекция и как только культура клеток продуцирует желаемое рекомбинантное антитело, ее регулярно собирают, очищенный и проанализированы или использованы для дальнейших экспериментов. Для получения рекомбинантных антител используются стабильные клеточные линии, такие как CHO и HEK293.[4] На начальных этапах производства рекомбинантных антител было важно добиться сборки функционального фрагмента Fv в кишечная палочка. Правильный складывать необходим для функционирования антитела.[15] Второй важной предпосылкой для современного производства scFv была успешная сборка рекомбинантных антител из тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина.[16] Эти два эксперимента позволили продолжить разработку и усовершенствование рекомбинантных антител до современной формы.

Гибридома

Дальнейшая информация: Гибридомная технология

Моноклональные антитела необходимы для многих методов лечения, применяемых сегодня в медицине человека. Первой успешной технологией, которая была надежной и привела к стабильному производству желаемых антител, была гибридомная технология. Клеточные линии гибридомы, которые продуцировали большие количества относительно чистых и предсказуемых антител, были впервые представлены в 1975 году.[17] С тех пор он использовался для различных целей - от диагностических и терапевтических до исследовательских. Несмотря на бесспорную роль в научных открытиях и многочисленных стратегиях лечения, гибридомная технология ставит исследователей перед некоторыми препятствиями, такими как этические проблемы, возможность потери экспрессии целевого белка или длительное производство и, что наиболее важно, развитие HAMA у пациентов, как упоминалось ранее.[4][18] Следовательно, необходимы различные методы для дополнения или даже частичной замены гибридомы. Гибридомы являются важной частью генерации рекомбинантных антител даже сегодня, поскольку они все еще используются для получения моноклональных антител, из которых Fab-фрагменты, scFv или соматически слитые антитела создают биспецифическое антитело.[5]

Фаговый дисплей

Основная статья: Фаговый дисплей

Наиболее часто применяемой технологией для производства рекомбинантных антител в лабораторных условиях сегодня является фаговый дисплей.[2][9][10][11][19][20] Фаговый дисплей - это метод, при котором целевое рекомбинантное антитело продуцируется на поверхности бактериофаг. Это позволяет быстро продуцировать рекомбинантные антитела и легко манипулировать в лабораторных условиях. Рекомбинантные антитела как scFv, так и фрагмент Fab обычно получают с использованием фагового дисплея антител.[10] Из всех возможных систем фагового дисплея наиболее распространенной является кишечная палочкаблагодаря быстрому росту и скорости разделения, а также дешевизне установки и обслуживания.[18]

Инжиниринг и разработка

Были описаны две основные стратегии для конструирования scFv-фрагментов. Первый - так называемый неколинеарный подход. Работает по принципу гетеродимеризация из двух цепей. Неколинеарный подход приводит к продукции диател и рекомбинантных антител, которые сочетают в себе две специфичности. Второй подход называется коллинеарный и описан процесс слияния двух различных scFv с биологически активным белком.[5]

Медицинские и исследовательские приложения

Рекомбинантные антитела выполняют широкий спектр функций, от исследований до диагностики и лечения различных заболеваний. Их специфичность и низкая иммуногенность делают их отличной альтернативой традиционным формам лечения, повышая точность нацеливания на определенные молекулы и избегая неблагоприятных побочных эффектов.

Рекомбинантные антитела были изучены как средство лечения рак,[21] ВИЧ,[22] Вирус простого герпеса (HSV)[20] и больше. ScFv были частью многообещающего терапевтического подхода универсальные химерные антигенные рецепторы (uniCAR), которая показывает многообещающие результаты. ScFv являются частью технологии в виде целевые модули, которые направляют иммунный ответ на специфические раковые клетки, экспрессирующие целевой антиген.[21][23][24] В случае исследования лечения ВИЧ рекомбинантные антитела скорее используются для их лечения. нейтрализующее качество.[22] То же самое и с инфекцией ВПГ. Специфические рекомбинантные антитела предназначены для связывания с поверхностью протеогликан сульфата гепарина (HSP), что затрудняет или даже препятствует проникновению HSV в клетку-хозяина. Это метод, который значительно снижает тяжесть инфекции HSV.[20]

Как упоминалось в начале этого раздела, рекомбинантные антитела также могут использоваться в диагностике, примером такого диагностического применения является обнаружение вирус бешенства.[3][18][25] Поскольку современные диагностические антитела не так точны, как хотелось бы, рекомбинантные антитела предлагают многообещающую альтернативу. В случае заражения бешенством, которое поддается лечению только вскоре после заражения, точный и точный диагноз жизненно важен для выживания пациента. По сравнению с коммерчески производимыми и общедоступными антителами рекомбинантные антитела дешевле в производстве и более точны в определении инфекции. Другим преимуществом рекомбинантного антитела является возможность его применения в качестве нейтрализующего антитела как часть последующего лечения.[18]

Потенциал рекомбинантных антител в медицине человека и животных огромен, как показывают даже несколько избранных примеров. Как упоминалось ранее, рекомбинантные антитела, особенно те, которые были разработаны при фаговом дисплее, являются высокоспецифичными, имеют большую фармакокинетика и может использоваться в широком спектре процедур. Однако важно понимать, что не ожидается или желательно, чтобы рекомбинантные антитела, созданные при фаговом дисплее, полностью заменяли продуцирование гибридомных антител, а скорее дополняли его.[4]

Преимущества использования рекомбинантных антител

Рекомбинантные антитела имеют много преимуществ при их применении в медицине и исследованиях человека. Первый - полное устранение этические вопросы потому что нет необходимости в животных иммунизация. Благодаря их размеру, который меньше, чем у полного антитела и, в частности, более 2000 нм,[26] но не менее 8 нм[27] они легко и своевременно выводятся из организма через почечный путь, что является желаемым клиренсом.[26][27] Еще одно большое преимущество - это их моновалентность, что означает, что они высокоспецифичны и связываются с одним антигеном. Исследователям удалось получить антитела, не обладающие никакой другой активностью, кроме связывания антигена.[9] Поскольку рекомбинантные антитела имеют определенную последовательность, они более надежны, а также воспроизводимы.[4] В сочетании с их малым размером можно использовать высокую специфичность для доставки высокоспецифичного лекарственного средства в конкретное место именно потому, что небольшой размер предрасполагает рекомбинантные антитела к более легкому проникновению в ткани. Сообщалось, что рекомбинантные антитела проникают в опухолевую ткань лучше, чем полноразмерные иммуноглобулины IgG.[28] Небольшой размер также улучшает биораспределение у пациента.[1] По сравнению с антителами, полученными из линий гибридомных клеток, рекомбинантные антитела не вызывают иммуногенности, печально известной человеческое антимышиное антитело (ХАМА).[4][19]

Это были главные преимущества использования у пациентов. Однако использование рекомбинантных антител также выгодно по сравнению с традиционными моноклональными антителами, полученными из линий гибридомных клеток, и во время их производства. Производство происходит намного быстрее, и мы лучше контролируем процесс, чем при использовании гибридомной технологии. Более того, рекомбинантные антитела могут быть сконструированы практически против любого антигена надлежащего размера и формы, но они не ограничиваются исключительно пептидной природой антигена. Рекомбинантные антитела также можно использовать в слитой форме с лекарственными средствами и / или токсинами, которые могут быть дополнительно использованы в медицинских целях. И последнее, но не менее важное из их преимуществ при производстве - это возможность оптимизировать и генетически сконструировать рекомбинантные антитела на основе текущих потребностей пациента или исследователя.[4]. Для выполнения фагового дисплея требуется опытный техник, и, в-третьих, почти неизбежно включение сторонних компаний в процесс синтеза генов и создания конструкции.[1][4]. Однако при систематическом сравнении антител животного происхождения рекомбинантных антител, полученных от фагового дисплея, полученных для исследовательских и диагностических целей, Справочная лаборатория ЕС по альтернативам испытаниям на животных (EURL ECVAM) выпустила рекомендацию в пользу антител неживотного происхождения в мае 2020 г.[29], в основном основанный на том факте, что в отличие от антител животного происхождения, рекомбинантные антитела всегда представляют собой белковые реагенты с определенной последовательностью, что позволяет устранить некоторые проблемы качества, связанные с текущими исследованиями антител при их производстве[30][31].

Рекомендации

  1. ^ а б c Creative Biolabs (2017-04-28), Введение рекомбинантных антител, получено 2017-08-18
  2. ^ а б c Ахмад, Зухайда Асра; Да, Суи Кеонг; Али, Абдул Манаф; Хо Ван Юн; Алитин, Нурджахан Бану Мохамед; Хамид, Мухаджир (2012). «Антитело scFv: принципы и клиническое применение». Клиническая иммунология и иммунология развития. 2012: 980250. Дои:10.1155/2012/980250. ISSN  1740-2522. ЧВК  3312285. PMID  22474489.
  3. ^ а б c Кунерт Р., Рейнхарт Д. (апрель 2016 г.). «Достижения в производстве рекомбинантных антител». Appl. Microbiol. Биотехнология. 100 (8): 3451–61. Дои:10.1007 / s00253-016-7388-9. ISSN  0175-7598. ЧВК  4803805. PMID  26936774.
  4. ^ а б c d е ж грамм час я Miltenyi Biotec (22.03.2017), Вебинар: Рекомбинантные антитела для улучшенной проточной цитометрии, получено 2017-08-20
  5. ^ а б c d е ж грамм Криангкум, Джитра; Сюй, Бивен; Nagata, Les P .; Фултон, Р. Элен; Суреш, Маванур Р. (2001). «Биспецифические и бифункциональные одноцепочечные рекомбинантные антитела». Биомолекулярная инженерия. 18 (2): 31–40. Дои:10.1016 / с1389-0344 (01) 00083-1. PMID  11535414.
  6. ^ Ма, Джулиан К.-С .; Hikmat, Ban Y .; Вайкофф, Кейт; Вайн, Николас Д .; Поверенный, Даниэль; Ю, Ллойд; Hein, Mich B .; Ленер, Томас (май 1998 г.). «Характеристика рекомбинантных моноклональных секреторных антител растений и профилактическая иммунотерапия у людей». Природа Медицина. 4 (5): 601–606. Дои:10,1038 / нм0598-601.
  7. ^ а б c Bio-Rad Laboratories (2013-12-03), Разработка рекомбинантных антиидиотипических антител для PK / PD и тестов иммуногенности, получено 2017-08-20
  8. ^ а б Глокшубер, Руди; Малия, Марк; Пфитцингер, Ильзе; Плюктхун, Андреас (13 февраля 1990). «Сравнение стратегий стабилизации Fv-фрагментов иммуноглобулина». Биохимия. 29 (6): 1362–1367. Дои:10.1021 / bi00458a002. ISSN  0006-2960. PMID  2110478.
  9. ^ а б c d Neri, D .; Петруль, Х .; Ронкуччи, Г. (август 1995 г.). «Разработка рекомбинантных антител для иммунотерапии». Биофизика клетки. 27 (1): 47–61. Дои:10.1007 / BF02822526. ISSN  0163-4992. PMID  7493398.
  10. ^ а б c d Френзель, Андре; Хаст, Майкл; Ширрманн, Томас (2013). «Экспрессия рекомбинантных антител». Границы иммунологии. 4: 217. Дои:10.3389 / fimmu.2013.00217. ISSN  1664-3224. ЧВК  3725456. PMID  23908655.
  11. ^ а б Йоргенсен, Матиас Линд; Фриис, Нильс Антон; Просто, Джеспер; Мадсен, Педер; Петерсен, Стин Ванг; Кристенсен, Питер (2014-01-15). «Экспрессия одноцепочечных вариабельных фрагментов, слитых с Fc-областью кроличьего IgG в Leishmania tarentolae». Фабрики микробных клеток. 13: 9. Дои:10.1186/1475-2859-13-9. ISSN  1475-2859. ЧВК  3917567. PMID  24428896.
  12. ^ Чжун, Нан; Лоппнау, Питер; Сеитова, Алма; Равичандран, Мани; Феннер, Мария; Джайн, харшика; Бхаттачарья, Ананди; Хатчинсон, Эшли; Падуч, Марчин (2015-10-05). «Оптимизация продукции антигенов и Fab в контексте создания рекомбинантных антител к человеческим белкам». PLOS ONE. 10 (10): e0139695. Bibcode:2015PLoSO..1039695Z. Дои:10.1371 / journal.pone.0139695. ISSN  1932-6203. ЧВК  4593582. PMID  26437229.
  13. ^ Arndt, M. A .; Krauss, J .; Киприянов, С. М .; Pfreundschuh, M .; Литтл, М. (1999-10-15). «Биспецифическое диатело, которое опосредует цитотоксичность естественных клеток-киллеров против ксенотрансплантированных опухолей Ходжкина человека». Кровь. 94 (8): 2562–2568. ISSN  0006-4971. PMID  10515858.
  14. ^ У, Чэнбинь; Инь, Хуа; Гриннелл, Кристина; Брайант, Шон; Миллер, Рене; Клабберс, Анка; Бозе, Сахана; Маккарти, Донна; Чжу, Ронг-Ронг (ноябрь 2007 г.). «Одновременное нацеливание на несколько медиаторов заболевания с помощью иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами». Природа Биотехнологии. 25 (11): 1290–1297. Дои:10.1038 / nbt1345. ISSN  1087-0156. PMID  17934452.
  15. ^ Skerra, A .; Плактун, А. (1988-05-20). «Сборка функционального фрагмента Fv иммуноглобулина в Escherichia coli». Наука. 240 (4855): 1038–1041. Дои:10.1126 / science.3285470. ISSN  0036-8075. PMID  3285470.
  16. ^ Босс, МА; Kenten, JH; Дерево, C R; Emtage, JS (1984-05-11). «Сборка функциональных антител из тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, синтезированных в E. coli». Исследования нуклеиновых кислот. 12 (9): 3791–3806. Дои:10.1093 / nar / 12.9.3791. ISSN  0305-1048. ЧВК  318790. PMID  6328437.
  17. ^ Köhler, G .; Мильштейн, К. (1975-08-07). «Непрерывные культуры слитых клеток, секретирующих антитела с заранее определенной специфичностью». Природа. 256 (5517): 495–497. Bibcode:1975Натура.256..495K. Дои:10.1038 / 256495a0. PMID  1172191.
  18. ^ а б c d Юань, Руосен; Чен, Сяосюй; Чен, Ян; Гу, Тиежун; Си, Хуалонг; Дуань, Е; Солнце, Бо; Ю, Сянхуи; Цзян, Чунлай (01.02.2014). «Подготовка и диагностическое использование нового рекомбинантного одноцепочечного антитела против гликопротеина вируса бешенства». Прикладная микробиология и биотехнология. 98 (4): 1547–1555. Дои:10.1007 / s00253-013-5351-6. ISSN  0175-7598. PMID  24241896.
  19. ^ а б Питерс, Джеффри А .; Ван, Сяовэй; Яп, Май Линь; Лим, Бок; Питер, Карлхайнц (13.07.2017). «Терапевтическое нацеливание в наномедицине: будущее за рекомбинантными антителами». Наномедицина. 12 (15): 1873–1889. Дои:10.2217 / nnm-2017-0043. ISSN  1743-5889. PMID  28703636.
  20. ^ а б c Багери, Вахид; Неджатоллахи, Форух; Эсмаили, Сейед Алиреза; Момтази, Амир Аббас; Мотамедифар, Мохамад; Сахебкар, Амирхоссейн (2017). «Нейтрализация человеческих рекомбинантных антител против гликопротеинов B вируса простого герпеса типа 1 из библиотеки scFv антител, представленных на фаге». Науки о жизни. 169: 1–5. Дои:10.1016 / j.lfs.2016.11.018. ЧВК  7094719. PMID  27888111.
  21. ^ а б Cartellieri, M .; Feldmann, A .; Користка, С .; Arndt, C .; Лофф, С .; Ehninger, A .; фон Бонин, М .; Bejestani, E.P .; Энингер, Г. (12 августа 2016 г.). «Включение и выключение CAR T-клеток: новая модульная платформа для перенацеливания Т-клеток на AML-бласты». Журнал рака крови. 6 (8): e458. Дои:10.1038 / bcj.2016.61. ЧВК  5022178. PMID  27518241.
  22. ^ а б Burton, D. R .; Pyati, J .; Koduri, R .; Sharp, S.J .; Thornton, G.B .; Паррен, П. У .; Сойер, Л. С .; Hendry, R.M .; Данлоп, Н. (1994-11-11). «Эффективная нейтрализация первичных изолятов ВИЧ-1 рекомбинантным человеческим моноклональным антителом». Наука. 266 (5187): 1024–1027. Bibcode:1994Научный ... 266.1024B. Дои:10.1126 / science.7973652. ISSN  0036-8075. PMID  7973652.
  23. ^ Голубовская, Вита; У Лицзюнь (15.03.2016). «Различные подмножества Т-клеток, памяти, эффекторных функций и иммунотерапии CAR-T». Рак. 8 (3): 36. Дои:10.3390 / раки8030036. ЧВК  4810120. PMID  26999211.
  24. ^ Альберт, Сюзанна; Арндт, Клаудия; Фельдманн, Аня; Бергманн, Ральф; Бахманн, Доминик; Користка, Стефания; Людвиг, Флориан; Циллер-Вальтер, Полина; Кеглер, Александра (2017-04-03). «Новый целевой модуль на основе нанотел для перенацеливания Т-лимфоцитов на раковые клетки, экспрессирующие EGFR, с помощью модульной платформы UniCAR». Онкоиммунология. 6 (4): e1287246. Дои:10.1080 / 2162402x.2017.1287246. ЧВК  5414885. PMID  28507794.
  25. ^ Ван, Дин-дин; Су, Человек-мужчина; Вс, Ян; Хуан, Шу-лин; Ван, Цзюй; Ян, Вэй-цюнь (2012). «Экспрессия, очистка и характеристика фрагмента человеческого одноцепочечного антитела Fv, слитого с Fc IgG1, нацеленного на антиген бешенства в Pichia pastoris». Экспрессия и очистка белков. 86 (1): 75–81. Дои:10.1016 / j.pep.2012.08.015. PMID  22982755.
  26. ^ а б Blanco E, Shen H, Ferrari M (сентябрь 2015 г.). «Принципы дизайна наночастиц для преодоления биологических барьеров на пути доставки лекарств». Nat. Биотехнология. 33 (9): 941–51. Дои:10.1038 / nbt.3330. ЧВК  4978509. PMID  26348965.
  27. ^ а б Лонгмайр, Мишель; Чойк, Питер Л .; Кобаяси, Хисатака (25 сентября 2008 г.). «Свойства просвета наноразмерных частиц и молекул как агентов визуализации: соображения и предостережения». Наномедицина. 3 (5): 703–717. Дои:10.2217/17435889.3.5.703. ISSN  1743-5889. ЧВК  3407669. PMID  18817471.
  28. ^ Yokota, T .; Миленик, Д. Э .; Whitlow, M .; Wood, J. F .; Hubert, S.L .; Шлом, Дж. (1993-08-15). «Микроавторадиографический анализ нормального распределения радиоактивного йода одноцепочечного Fv в органах и других форм иммуноглобулинов». Исследования рака. 53 (16): 3776–3783. ISSN  0008-5472. PMID  8339291.
  29. ^ Рекомендация EURL ECVAM по антителам неживотного происхождения. Бюро публикаций Европейского Союза. 2020. ISBN  978-92-76-18346-4.
  30. ^ Бейкер, Моня (май 2015 г.). «Кризис воспроизводимости: во всем виноваты антитела». Природа. 521 (7552): 274–276. Дои:10.1038 / 521274a.
  31. ^ Гудман, Саймон. Л. (октябрь 2018). «Шоу ужасов с антителами: вводное руководство для недоумевших». Новая биотехнология. 45: 9–13. Дои:10.1016 / j.nbt.2018.01.006.