Вектор трансформации растений - Plant transformation vector

Векторы трансформации растений находятся плазмиды которые были специально разработаны для облегчения создания трансгенных растений. Наиболее часто используемые векторы трансформации растений называются двоичные векторы из-за их способности воспроизводиться в обоих Кишечная палочка, обычная лабораторная бактерия, и Agrobacterium tumefaciens, бактерия, используемая для вставки рекомбинантной (адаптированной) ДНК в растения. Векторы трансформации растений содержат три ключевых элемента;

Выбор плазмид (создание собственной кольцевой цепи ДНК)
Репликация плазмид (чтобы с ней можно было легко работать)
Перенести ДНК (Т-ДНК) область (вставка ДНК в агробактерии)

Этапы трансформации растений

Распространение двоичного вектора в Кишечная палочка

Изолировать двоичный вектор от Кишечная палочка и инженер (ввести чужой ген)

Вновь ввести сконструированный двоичный вектор в Кишечная палочка усилить

Выделите спроектированный двоичный вектор и введите в Агробактерии содержащий модифицированную (относительно небольшую) плазмиду Ti

Заразить растительную ткань с помощью инженерных Агробактерии (Т-ДНК, содержащая чужеродный ген, вставляется в геном растительной клетки)

В каждой клетке Т-ДНК интегрируется в разные участки генома.

Примечание. Есть много вариантов этих шагов. Пользовательская последовательность плазмиды ДНК может быть создана и реплицирована более чем одним способом.

Последствия прошивки

Вставлена чужеродная ДНК

Вставной мутагенез (но не смертельный для растительной клетки - организм диплоиден)

Проблема

Мы хотим преобразовать весь организм, а не только одну клетку. Это делается путем трансформации растительных клеток в культуре, отбора трансформированных клеток и регенерации всего растения из трансформированной клетки (например, табака).

Выбор плазмиды

Когда бактерии с желаемым имплантированным геном вырастают, их получают с селектором. Селектор - это способ выделить и выделить нужные ячейки. Ген, который делает клетки устойчивыми к антибиотикам, таким как антибиотики. канамицин, ампициллин, спектиномицин или же тетрациклин, это простой в использовании селектор. Желаемые клетки (наряду с любыми другими организмами, растущими в культуре) можно обрабатывать антибиотиком, позволяя нужным клеткам выжить, в то время как другие организмы не могут. Ген антибиотика обычно не передается в растительную клетку, но остается внутри бактериальной клетки.

Репликация плазмид

Плазмиды реплицируются для производства множества плазмидных молекул в каждой бактериальной клетке-хозяине. Количество копий каждой плазмиды в бактериальной клетке определяется источник репликации. Это положение в молекуле плазмиды, где начинается репликация ДНК. Наиболее двоичные векторы имеют большее количество копий плазмид, когда они реплицируются в Кишечная палочка число копий плазмиды обычно меньше, когда плазмида находится внутри Agrobacterium tumefaciens.Плазмиды также могут быть воспроизведены в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Область Т-ДНК

Т-ДНК содержит два типа генов: онкогенные гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе ауксинов и цитокининов и ответственные за образование опухолей; и гены, кодирующие синтез опинов. Эти соединения, образующиеся при конденсации аминокислот и сахаров, синтезируются и выводятся клетками краун-галла и потребляются A. tumefaciens в качестве источников углерода и азота. Вне Т-ДНК расположены гены катаболизма опина, гены, участвующие в процессе переноса Т-ДНК от бактерии к растительной клетке, и гены, участвующие в конъюгативном переносе бактериально-бактериальной плазмиды. (Hooykaas and Schilperoort, 1992; Zupan and Zambrysky, 1995). Фрагмент Т-ДНК фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н., которые действуют как сигнал цис-элемента для аппарата переноса. Процесс переноса Т-ДНК опосредуется совместным действием белков, кодируемых генами, определенными в области вирулентности плазмиды Ti (гены vir) и в бактериальной хромосоме. Плазмида Ti также содержит гены катаболизма опина, продуцируемые клетками краун-галла, и области для конъюгативного переноса, а также собственной целостности и стабильности. Область вирулентности (vir) размером 30 т.п.н. - это регулон, организованный из шести оперонов, которые необходимы для передачи Т-ДНК (virA, virB, virD и virG) или для повышения эффективности переноса (virC и virE) (Hooykaas and Schilperoort , 1992; Zupan, Zambryski, 1995, Jeon et al., 1998). Различные генетические элементы, определенные хромосомами, показали свою функциональную роль в прикреплении A. tumefaciens к растительной клетке и бактериальной колонизации: локусы chvA и chvB, участвующие в синтезе и экскреции b -1,2-глюкана (Cangelosi et al. ., 1989); chvE, необходимого для увеличения сахара в индукции генов vir и бактериального хемотаксиса (Ankenbauer et al., 1990, Cangelosi et al., 1990, 1991); локус cel, ответственный за синтез фибрилл целлюлозы (Matthysse 1983); локус pscA (exoC), играющий свою роль в синтезе как циклического глюкана, так и кислого сукциногликана (Cangelosi et al., 1987, 1991); и локус att, который участвует в белках клеточной поверхности (Matthysse, 1987).