Масс-спектрометрическая визуализация - Mass spectrometry imaging

Масс-спектрометрическая визуализация (MSI) - техника, используемая в масс-спектрометрии для визуализации пространственного распределения молекул, как биомаркеры, метаболиты, пептиды или же белки по их молекулярным массам. После сбора масс-спектра в одном месте образец перемещается, чтобы достичь другой области, и так далее, пока не будет сканирован весь образец. Выбрав пик в результирующих спектрах, который соответствует интересующему соединению, данные МС используются для отображения его распределения по образцу. В результате получаются изображения пространственно разрешенного распределения составного пикселя за пикселем. Каждый набор данных содержит настоящую галерею изображений, потому что любой пик в каждом спектре может быть нанесен на карту в пространстве. Несмотря на то, что MSI обычно считается качественным методом, сигнал, генерируемый этим методом, пропорционален относительному содержанию аналита. Следовательно, количественная оценка возможна, когда ее проблемы будут преодолены. Хотя широко используются традиционные методологии, такие как радиохимия и иммуногистохимия достигают той же цели, что и MSI, они ограничены в своих возможностях анализировать несколько образцов одновременно и могут оказаться недостаточными, если исследователи не имеют предварительных знаний об исследуемых образцах.[1] Наиболее распространенные ионизационные технологии в области MSI: Визуализация DESI, MALDI визуализация и вторично-ионной масс-спектрометрии изображения (ВИМС визуализация ).[2][3]

История

Более 50 лет назад MSI была представлена ​​с использованием вторично-ионная масс-спектрометрия (SIMS) для исследования поверхностей полупроводников Кастеном и Слодзианом.[4] Однако это была новаторская работа Ричарда Каприоли и его коллег в конце 1990-х годов, продемонстрировавшая, как матричная лазерная десорбция / ионизация (MALDI) может быть применен для визуализации больших биомолекул (в виде белков и липидов) в клетках и тканях, чтобы выявить функцию этих молекул и то, как функция изменяется при таких заболеваниях, как рак, что привело к широкому использованию MSI. В настоящее время используются различные методы ионизации, включая SIMS, MALDI и десорбционная ионизация электрораспылением (DESI), а также другие технологии. Тем не менее, MALDI в настоящее время является доминирующей технологией в клинических и биологических приложениях MSI.[5]

Принцип работы

MSI основан на пространственном распределении выборки. Следовательно, принцип работы зависит от метода, который используется для получения пространственной информации. В MSI используются два метода: микрозонд и микроскоп.[6]

Микрозонд

Этот метод выполняется с использованием сфокусированного ионизационного пучка для анализа определенной области образца путем создания масс-спектра. Масс-спектр сохраняется вместе с пространственной координацией, в которой проводились измерения. Затем выбирается новая область и анализируется путем перемещения образца или ионизационного луча. Эти шаги повторяются до тех пор, пока не будет отсканирован весь образец. Объединив все индивидуальные масс-спектры, можно построить карту распределения интенсивностей в зависимости от положений x и y. В результате получают реконструированные молекулярные изображения образца.[6]

Микроскоп

В этой технике 2D позиционно-чувствительный Детектор используется для измерения пространственного происхождения ионов, генерируемых на поверхности образца ионной оптикой приборов. Разрешение пространственной информации будет зависеть от увеличения микроскопа, качества ионной оптики и чувствительности детектора. Новый регион по-прежнему нужно сканировать, но количество позиций резко сокращается. Ограничением этого режима является конечная глубина зрения, доступная для всех микроскопов.[6]

Зависимость от источника ионов

Доступные для IMS методы ионизации подходят для различных приложений. Некоторые из критериев выбора метода ионизации - это требования к подготовке образца и параметры измерения, такие как разрешение, диапазон масс и чувствительность. Исходя из этого, наиболее распространенными методами ионизации являются: МАЛДИ, SIMS И DESI которые описаны ниже. Тем не менее, другие второстепенные методы лазерная абляция ионизация электрораспылением (LAESI) и яазер-абляция-индуктивно связанная плазма (LA-ICP).

ВИМС визуализация

Масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS) используется для анализа твердых поверхностей и тонкие пленки к распыление поверхность со сфокусированным первичным ионный пучок и сбор и анализ выброшенных вторичных ионов. Есть много разных источников первичного ионного пучка. Однако первичный ионный пучок должен содержать ионы, которые находятся на верхнем конце шкалы энергии. Некоторые общие источники: Cs+, O2+, O, Ar+ и Ga+.[7] Визуализация SIMS выполняется аналогично электронная микроскопия; пучок первичных ионов излучается через образец, в то время как регистрируются вторичные масс-спектры.[8] ВИМС доказала свою эффективность в обеспечении наивысшего разрешения изображения, но только на небольшой площади образцов.[9] Более того, этот метод широко считается одной из наиболее чувствительных форм масс-спектрометрии, поскольку он может обнаруживать элементы в концентрациях всего 1012-1016 атомов на кубический сантиметр.[10][примечание 1][заметка 2]


Мультиплексная ионно-лучевая визуализация (MIBI) - это метод SIMS, который использует меченые изотопами металлов антитела для маркировки соединений в биологических образцах.[11]

Изменения в SIMS: В SIMS были внесены некоторые химические модификации для повышения эффективности процесса. В настоящее время используются два отдельных метода, которые помогают повысить общую эффективность за счет увеличения чувствительности измерений SIMS: SIMS с улучшенной матрицей (ME-SIMS). Подготовка образца такая же, как и в MALDI, поскольку он имитирует свойства химической ионизации MALDI. . ME-SIMS не отбирает столько материала. Однако, если тестируемый аналит имеет низкое значение массы, он может давать спектры, похожие на спектры MALDI. ME-SIMS оказался настолько эффективным, что смог обнаруживать химические вещества с малой массой на субклеточных уровнях, что было невозможно до разработки техники ME-SIMS.[3] Второй используемый метод называется металлизацией образца (Meta-SIMS) - это процесс добавления золота или серебра в образец. Вокруг образца образуется слой золота или серебра, обычно толщиной не более 1-3 нм. Использование этого метода привело к увеличению чувствительности для образцов большей массы. Добавление металлического слоя также позволяет преобразовывать изолирующие образцы в проводящие образцы, поэтому компенсация заряда в экспериментах SIMS больше не требуется.[12]

MALDI визуализация

Почки мыши: (а) MALDI-спектры ткани. (b) Ткань, окрашенная H&E. N-гликаны с m / z = 1996,7 (c) расположены в коре и мозговом веществе, а m / z = 2158,7 (d) - в коре головного мозга, (e) наложенное изображение этих двух масс, (f) необработанная контрольная ткань .[13]
Основная статья: MALDI визуализация

Матричная лазерная десорбционная ионизация может использоваться в качестве метода построения изображений масс-спектрометрии для относительно больших молекул.[3] Недавно было показано, что наиболее эффективным типом матрицы для использования является ионная матрица для MALDI-визуализации ткани. В этом варианте методики образец, как правило, тонкий ткань раздел, перемещается в двух измерениях, в то время как масс-спектр записывается.[14] Хотя MALDI имеет то преимущество, что может регистрировать пространственное распределение более крупных молекул, он достигается за счет более низкого разрешения, чем метод SIMS. Предел латерального разрешения для большинства современных инструментов, использующих MALDI, составляет 20 м. В экспериментах MALDI обычно используется либо Nd: YAG (355 нм), либо N2 (337 нм) лазер для ионизации.[3]

Фармакодинамика и токсикодинамика в тканях были изучены с помощью MALDI-визуализации.[15]

Визуализация DESI

Десорбция с электрораспылением. Ионизация - менее деструктивный метод, сочетающий простоту и быстрый анализ образца. На образец распыляется электрически заряженный туман растворителя под углом, который вызывает ионизацию и десорбцию различных молекулярных частиц. Затем создаются двумерные карты содержания выбранных ионов на поверхности образца в зависимости от пространственного распределения.[16][9] Этот метод применим к твердым, жидким, замороженным и газообразным образцам. Кроме того, DESI позволяет анализировать широкий спектр органических и биологических соединений, таких как ткани животных и растений, а также образцы культур клеток, без сложной пробоподготовки.[5][9] Хотя этот метод имеет самое низкое разрешение среди прочего, он может создавать высококачественное изображение из сканирования большой площади, как сканирование всего участка тела.[9]

Сравнение методов ионизации

Сравнение типичных параметров среди методов IMS[9]
Источник ионизацииТип ионизацииАналитыПространственное разрешениеДиапазон масс
SIMSИонная пушкаЖесткийЭлементарные ионы, малые молекулы, липиды<10 м0-1000 Да
МАЛДИУФ лазерный лучМягкийЛипиды, пептиды, белки20 м0-100 000 Да
DESIРастворитель спрейМягкийНебольшие молекулы, липиды, пептиды50 м0-2000 Да

Сочетание различных методов IMS и других методов визуализации

Комбинирование различных методов IMS может быть полезным, поскольку каждый конкретный метод имеет свои преимущества. Например, когда информация, касающаяся белков и липидов, необходима в одном и том же срезе ткани, выполнение DESI для анализа липида, затем MALDI для получения информации о пептиде и завершение применения окрашивания (гематоксилин и эозин) для медицинской диагностики структурная характеристика ткани.[9] С другой стороны IMS с другими методами визуализации, флуоресцентное окрашивание с IMS и магнитно-резонансная томография (МРТ) с помощью МРТ можно выделить. Флуоресцентное окрашивание может дать информацию о внешнем виде некоторых белков, присутствующих в любом процессе внутри ткани, в то время как IMS может дать информацию о молекулярных изменениях, представленных в этом процессе. Комбинируя оба метода, можно получить мультимодальное изображение или даже трехмерное изображение распределения различных молекул.[9] Напротив, МРТ с IMS объединяет непрерывное 3D-представление изображения MRI с подробным структурным представлением с использованием молекулярной информации из IMS. Несмотря на то, что сама IMS может генерировать трехмерные изображения, изображение является лишь частью реальности из-за ограничения глубины анализа, в то время как МРТ обеспечивает, например, подробную форму органа с дополнительной анатомической информацией. Этот комбинированный метод может быть полезен для точной диагностики рака и нейрохирургии.[9]

Обработка данных

Стандартный формат данных для наборов данных масс-спектрометрии

Полезным форматом данных для IMS является формат данных imML (imzML ), потому что его поддерживают несколько программных инструментов MS для работы с образами. Преимущество этого формата заключается в гибкости обмена данными между различными приборами и программным обеспечением для анализа данных.[17]

Программного обеспечения

Доступно множество бесплатных программных пакетов для визуализации и анализа данных масс-спектрометрии. Конвертеры из формата Thermo Fisher, формата Analyze, формата GRD и формата Bruker в формат imzML были разработаны проектом Computis. Некоторые программные модули также доступны для просмотра изображений масс-спектрометрии в формате imzML: Biomap (Novartis, бесплатно), Datacube Explorer (AMOLF, бесплатно),[18] EasyMSI (CEA), Mirion (JLU), MSiReader (NCSU, бесплатно)[19] и SpectralAnalysis.[20]

Для обработки файлов .imzML с помощью бесплатного статистического и графического языка R доступен набор сценариев R, который позволяет выполнять параллельную обработку больших файлов на локальном компьютере, удаленном кластере или в облаке Amazon.[21]

Существует еще один бесплатный статистический пакет для обработки данных imzML и Analyze 7.5 в R, Cardinal.[22]

СПУТНИК [23] представляет собой пакет R, содержащий различные фильтры для удаления пиков, характеризующихся некоррелированным пространственным распределением с местоположением образца.

Приложения

Замечательная способность IMS - обнаруживать локализацию биомолекул в тканях, хотя ранее о них нет никакой информации. Эта особенность сделала IMS уникальным инструментом для клинических исследований и фармакологических исследований. Он предоставляет информацию о биомолекулярных изменениях, связанных с заболеваниями, путем отслеживания белков, липидов и клеточного метаболизма. Например, определение биопроизводителей с помощью IMS может показать подробный диагноз рака. Кроме того, можно получить недорогую визуализацию для исследований фармацевтических препаратов, например изображения молекулярных сигнатур, которые могут указывать на терапевтический ответ на конкретное лекарство или эффективность конкретного метода доставки лекарственного средства.[24][25][26]

Преимущества, проблемы и ограничения

Основное преимущество MSI для изучения расположения и распределения молекул в ткани заключается в том, что этот анализ может обеспечить либо большую селективность, больше информации или большую точность, чем другие. Более того, этот инструмент требует меньше затрат времени и ресурсов для получения аналогичных результатов.[16] В таблице ниже показано сравнение преимуществ и недостатков некоторых доступных методов, включая MSI, в сопоставлении с анализом распределения лекарств.[4]

Сравнение преимуществ и недостатков методик оценки распределения лекарств[4]
МетодологияОтвет на вопросПреимуществаНедостатки
АвторадиографияГде и сколько радиоактивностиОчень высокое пространственное разрешение; надежное количественное определениеEx vivo; требуется радиоактивно меченый препарат; не отличает препарат от метаболитов.
ИммуногистохимияГдеКороткое время обработки; легкая интерпретация; недорогойEx vivo; требуются антитела, которые различаются по чувствительности и специфичности; определение трудностей; порог обнаружения; отсутствие стандартной системы подсчета очков
ФлуоресценцияГдеВозможно in vivo; разумная стоимостьНе количественный; плохое разрешение; автофлуоресцентная интерференция
Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ)Где, что и активностьВозможно in vivo; хорошее разрешение; может быть соединен с КТ-рентгеном, гамма-камеройДорогой; короткоживущие изотопы; нужен циклотрон для производства изотопов
Когерентный антистоксов

Рамановское рассеяние

микроскопия (CARS)

Где и чтоБез этикеток; субклеточное пространственное разрешениеНе количественный; плохая селективность; высокий фоновый шум
Электрохимический атомный

силовая микроскопия (АСМ)

Где и чтоИзображение без этикеток; высокое разрешениеНе количественный; плохая воспроизводимость; высокий фон
MSIГде и чтоМультиплекс; изображения без этикеток; хорошее пространственное разрешениеПолуколичественный; эффекты подавления ионов; комплексный анализ

Примечания

  1. ^ для сравнения, в 1 куб. см углерода (алмаза) содержится примерно 1,8 x 1023 атомы. 1012 до 1016 соответствует от 6 частей на триллион (ppt) до 60 частей на миллиард (ppb).
  2. ^ чувствительность зависит от элемента (или молекулы), а также от природы анализируемой поверхности и условий анализа.

Рекомендации

  1. ^ Монро Э, Аннангуди С., Хэтчер Н., Гутштейн Х, Рубахин С., Свидлер Дж. (2008). «Визуализация спинного мозга по SIMS и MADLI MS». Протеомика. 8 (18): 3746–3754. Дои:10.1002 / pmic.200800127. ЧВК  2706659. PMID  18712768.
  2. ^ Ронер Т., Стааб Д., Стоекли М. (2005). «MALDI масс-спектрометрическая визуализация срезов биологических тканей». Механизмы старения и развития. 126 (1): 177–185. Дои:10.1016 / j.mad.2004.09.032. PMID  15610777.
  3. ^ а б c d Макдоннелл Л.А., Херен Р.М. (2007). «Изображающая масс-спектрометрия». Обзоры масс-спектрометрии. 26 (4): 606–43. Bibcode:2007MSRv ... 26..606M. Дои:10.1002 / mas.20124. HDL:1874/26394. PMID  17471576.
  4. ^ а б c Cobice, D. F; Гудвин, Р. Дж. А; Андрен, П. Э .; Нильссон, А; Mackay, C.L; Эндрю, Р. (2015-07-01). «Взгляд на технологии будущего: получение изображений масс-спектрометрии как инструмент исследований и разработок лекарственных средств». Британский журнал фармакологии. 172 (13): 3266–3283. Дои:10.1111 / bph.13135. ISSN  1476-5381. ЧВК  4500365. PMID  25766375.
  5. ^ а б Адди, Рубен Д .; Баллафф, Бенджамин; Бови, Джудит В. М. Г .; Морро, Ганс; Макдоннелл, Лиам А. (2015). «Текущее состояние и будущие задачи масс-спектрометрической визуализации для клинических исследований». Аналитическая химия. 87 (13): 6426–6433. Дои:10.1021 / acs.analchem.5b00416. PMID  25803124.
  6. ^ а б c McDonnell, Liam A .; Херен, Рон М.А. (2007-07-01). «Изображающая масс-спектрометрия». Обзоры масс-спектрометрии. 26 (4): 606–643. Bibcode:2007MSRv ... 26..606M. Дои:10.1002 / mas.20124. HDL:1874/26394. ISSN  1098-2787. PMID  17471576.
  7. ^ Амстальден Ван Хов Э, Смит Д., Хеерен Р. (2010). «Краткий обзор изображений масс-спектрометрии». Журнал хроматографии А. 1217 (25): 3946–3954. Дои:10.1016 / j.chroma.2010.01.033. PMID  20223463.
  8. ^ Пеннер-Хан, Джеймс Э. (2013). «Глава 2. Технологии обнаружения металлов в одиночных ячейках. Раздел 2.1, Масс-спектрометрия вторичных ионов». В Банчи, Лючия (ред.). Металломика и клетка. Ионы металлов в науках о жизни. 12. Springer. С. 15–40. Дои:10.1007/978-94-007-5561-1_2. ISBN  978-94-007-5560-4. PMID  23595669.электронная книга ISBN  978-94-007-5561-1 ISSN  1559-0836 электронный-ISSN  1868-0402
  9. ^ а б c d е ж грамм час Бодзон-Кулаковская, Анна; Судер, Петр (01.01.2016). «Масс-спектрометрия с визуализацией: приборы, приложения и комбинация с другими методами визуализации». Обзоры масс-спектрометрии. 35 (1): 147–169. Bibcode:2016MSRv ... 35..147B. Дои:10.1002 / mas.21468. ISSN  1098-2787. PMID  25962625.
  10. ^ Чабала Дж., Сони К., Ли Дж., Гавлиров К., Леви-Сетти Р. (1995). «Химическая визуализация высокого разрешения со сканирующим ионным зондом SIMS». Международный журнал масс-спектрометрии и ионных процессов. 143: 191–212. Bibcode:1995IJMSI.143..191C. Дои:10.1016 / 0168-1176 (94) 04119-П.
  11. ^ Анджело, Майкл; Бендалл, Шон С; Финк, Рэйчел; Хейл, Мэтью Б; Хицман, Чак; Боровский, Александр Д; Левенсон, Ричард М; Лоу, Джон Б; Лю, Скотт Д.; Чжао, Шучунь; Наткунам, Ясодха; Нолан, Гарри П. (2014). «Мультиплексная ионно-лучевая визуализация опухолей груди человека». Природа Медицина. 20 (4): 436–442. Дои:10,1038 / нм.3488. ISSN  1078-8956. ЧВК  4110905. PMID  24584119.
  12. ^ Delcorte A, Befahy S, Poleunis C, Troosters M, Bertrand P. "Улучшение адгезии металла к кремниевым пленкам: исследование ToF-SIMS". Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  13. ^ Пауэрс, Томас У .; Neely, Benjamin A .; Шао, Юань; Тан, Хуэйюань; Troyer, Dean A .; Mehta, Anand S .; Хааб, Брайан Б.; Дрейк, Ричард Р. (2014). "MALDI Imaging Mass Spectrometry Profiling N-Glycans в фиксированных формалином парафиновых блоках клинических тканей и тканевых микрочипах". PLoS ONE. 9 (9): e106255. Bibcode:2014PLoSO ... 9j6255P. Дои:10.1371 / journal.pone.0106255. ISSN  1932-6203. ЧВК  4153616. PMID  25184632.
  14. ^ Чауранд П., Норрис Дж. Л., Корнетт Д. С., Мобли Дж. А., Каприоли Р. М. (2006). «Новые разработки в профилировании и визуализации белков из срезов тканей с помощью масс-спектрометрии MALDI». J. Proteome Res. 5 (11): 2889–900. Дои:10.1021 / pr060346u. PMID  17081040.
  15. ^ Патель, Экта (1 января 2015 г.). «MALDI-MS визуализация для исследования фармакодинамики и токсикодинамики тканей». Биоанализ. 7 (1): 91–101. Дои:10.4155 / bio.14.280. PMID  25558938.
  16. ^ а б Нильссон, Анна; Гудвин, Ричард Дж. А .; Шариатгорджи, Мохаммадреза; Валлианату, Феодосия; Уэбборн, Питер Дж. Х .; Андрен, Пер Э. (03.02.2015). «Масс-спектрометрическая визуализация в разработке лекарств». Аналитическая химия. 87 (3): 1437–1455. Дои:10.1021 / ac504734s. ISSN  0003-2700. PMID  25526173.
  17. ^ А. Ремпп; Т. Шрамм; А. Хестер; И. Клинкерт; J.P. Оба; Р.М.А. Херен; М. Стоекли; Б. Шпенглер (2011). «Глава imzML: Язык разметки для масс-спектрометрии изображений: общий формат данных для построения изображений масс-спектрометрии в интеллектуальном анализе данных в протеомике: от стандартов к приложениям». Методы молекулярной биологии, Humana Press, Нью-Йорк. 696. С. 205–224.
  18. ^ Klinkert, I .; Чухтай, К .; Ellis, S. R .; Херен, Р. М. А. (2014). «Методы исследования и визуализации данных с полным разрешением для больших массивов данных масс-спектрометрии 2D и 3D». Международный журнал масс-спектрометрии. 362: 40–47. Bibcode:2014IJMSp.362 ... 40K. Дои:10.1016 / j.ijms.2013.12.012.
  19. ^ Robichaud, G .; Garrard, K. P .; Barry, J. A .; Муддиман, Д. К. (2013). «MSiReader: интерфейс с открытым исходным кодом для просмотра и анализа файлов изображений MS с высокой разрешающей способностью на платформе Matlab». Журнал Американского общества масс-спектрометрии. 24 (5): 718–721. Bibcode:2013JASMS..24..718R. Дои:10.1007 / s13361-013-0607-z. ЧВК  3693088. PMID  23536269.
  20. ^ Раса, А. М .; Palmer, A.D .; Декстер, А .; Steven, R.T .; Стили, И. Б .; Банч, Дж. (2016). «SpectralAnalysis: программное обеспечение для масс» (PDF). Аналитическая химия. 88 (19): 9451–9458. Дои:10.1021 / acs.analchem.6b01643. PMID  27558772.
  21. ^ Гамбоа-Бесерра, Роберто; Рамирес-Чавес, Энрике; Молина-Торрес, Хорхе; Винклер, Роберт (01.07.2015). «Скрипты MSI.R обнаруживают летучие и полулетучие свойства в низкотемпературной плазменной масс-спектрометрии (LTP-MSI) чили (Capsicum annuum)». Аналитическая и биоаналитическая химия. 407 (19): 5673–5684. Дои:10.1007 / s00216-015-8744-9. PMID  26007697.
  22. ^ Бемис, Кайл Д .; Гарри, апрель; Эберлин, Ливия С .; Феррейра, Кристина; ван де Вен, Стефани М .; Маллик, Параг; Столовиц, Марк; Витек, Ольга (15.03.2015). "Кардинал: пакет R для статистического анализа экспериментов с изображениями на основе масс-спектрометрии ". Биоинформатика. 31 (14): 2418–2420. Дои:10.1093 / биоинформатика / btv146. ЧВК  4495298. PMID  25777525.
  23. ^ Английский, Паоло; Коррейя, Гонсало; Такац, Золтан; Николсон, Джереми К .; Глен, Роберт С. (2018). «СПУТНИК: пакет R для фильтрации пространственно связанных пиков в данных масс-спектрометрии». Биоинформатика. 35 (1): 178–180. Дои:10.1093 / биоинформатика / bty622. ЧВК  6298046. PMID  30010780.
  24. ^ Swales, Джон Дж .; Хамм, Грегори; Clench, Malcolm R .; Гудвин, Ричард Дж. (Март 2019 г.). «Масс-спектрометрическая визуализация и ее применение в фармацевтических исследованиях и разработках: краткий обзор». Международный журнал масс-спектрометрии. 437: 99–112. Дои:10.1016 / j.ijms.2018.02.007. ISSN  1387-3806.
  25. ^ Адди, Рубен Д .; Баллафф, Бенджамин; Бови, Джудит В. М. Г .; Морро, Ганс; Макдоннелл, Лиам А. (07.07.2015). «Текущее состояние и будущие задачи масс-спектрометрической визуализации для клинических исследований». Аналитическая химия. 87 (13): 6426–6433. Дои:10.1021 / acs.analchem.5b00416. ISSN  0003-2700. PMID  25803124.
  26. ^ Айхлер, Микаэла; Вальх, Аксель (апрель 2015 г.). «MALDI Imaging масс-спектрометрия: современные рубежи и перспективы в исследованиях и практике патологии». Лабораторные исследования. 95 (4): 422–431. Дои:10.1038 / labinvest.2014.156. ISSN  1530-0307. PMID  25621874.