Подавление ионов в жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии. - Ion suppression in liquid chromatography–mass spectrometry

Ионное подавление в ЖХ-МС и ЖХ-МС / МС означает пониженный отклик детектора, или сигнал: шум как проявленный эффект конкуренции за эффективность ионизации в источник ионизации, между интересующим аналитом (ами) и другими эндогенный или же экзогенный (например, пластификаторы из пластиковых туб,^[1] добавки подвижной фазы) виды, которые не были удалены из образца матрица в течение Базовые приготовления. Подавление ионов не является проблемой, если мешающие соединения элюируются одновременно с исследуемым аналитом. В случаях, когда частицы, подавляющие ионы, действительно элюируются совместно с аналитом, влияние на важные аналитические параметры, включая точность, аккуратность и предел обнаружения (аналитическая чувствительность) может быть значительной, что серьезно ограничивает достоверность результатов анализа.^[2]

История

Вначале как инструмент аналитическая химия, ЖХ-МС / МС быстро распространяется и действительно продолжает распространяться (среди прочего) биоаналитический полей, благодаря своей селективности в отношении интересующих аналитов. Действительно, во многих случаях такая селективность может привести к неправильному представлению о том, что всегда можно упростить или (в некоторых случаях) почти полностью устранить необходимость в обширной пробоподготовке. Следовательно, ЖХ-МС / МС стал предпочтительным аналитическим инструментом для биоанализа благодаря его впечатляющей чувствительности и селективности по сравнению с другими, более традиционными хроматографическими подходами. Однако во время и после внедрения биоаналитическими лабораториями по всему миру стало очевидно, что существуют проблемы, связанные с обнаружением относительно небольших концентраций аналита в сложных матрицах проб, связанных с биологическими жидкостями (например, кровь и моча).^[3]

Предлагаемые механизмы подавления ионов

Проще говоря, подавление ионов описывает неблагоприятное влияние на отклик детектора из-за снижения эффективности ионизации интересующего (-ых) аналита (-ов) в результате присутствия частиц в матрица образцов которые конкурируют за ионизацию или препятствуют эффективной ионизации другими способами. Использование МС / МС в качестве средства обнаружения может создать впечатление отсутствия мешающих веществ, поскольку хроматографические примеси не обнаруживаются. Однако виды, которые не являются изобарическими, могут по-прежнему оказывать неблагоприятное воздействие на чувствительность, точность и точность анализа из-за подавления ионизации интересующего аналита.^[4]

Хотя точные химические и физические факторы, участвующие в подавлении ионов, полностью не изучены, было высказано предположение, что основность, высокая концентрация, масса и, что более интуитивно, совместное элюирование с представляющим интерес аналитом являются факторами, которые не следует игнорировать.^[5]

Наиболее распространенные методы ионизации при атмосферном давлении, используемые в ЖХ-МС / МС: ионизация электрораспылением (ESI) и химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). APCI менее подвержен выраженному ионному подавлению, чем ESI,^[6] неотъемлемое свойство соответствующих механизмов ионизации.

В APCI единственный источник подавления ионов можно отнести к изменению коллигативных свойств растворенного вещества во время испарения (King et al, J. Am. Soc. Mass Spectrom 2000, 11, 942-950).

ESI имеет более сложный механизм ионизации, в значительной степени зависящий от избыточного заряда капель, и поэтому существует множество других факторов, которые следует учитывать при изучении причины подавления ионов. Широко наблюдалось, что для многих аналитов при высоких концентрациях ESI демонстрирует потерю отклика детектора. линейность, возможно, из-за уменьшенного избытка заряда, вызванного насыщением аналита на поверхности капли, что препятствует последующему выбросу ионов газовой фазы изнутри капли. Таким образом, конкуренция за пространство и / или заряд может рассматриваться как источник подавления ионов в ESI. Как физические, так и химические свойства аналитов (например, основность и поверхностная активность) определяют присущую им эффективность ионизации. Матрицы биологических образцов, как правило, содержат множество эндогенных видов с высокой основностью и поверхностной активностью, поэтому общая концентрация этих видов в образце быстро достигнет уровней, при которых следует ожидать подавления ионов.

Другое объяснение подавления ионов в ESI касается физических свойств самой капли, а не присутствующих частиц. Высокие концентрации мешающих компонентов приводят к увеличению поверхностного натяжения и вязкости, что приводит к снижению десольватации (испарения растворителя), что, как известно, оказывает заметное влияние на эффективность ионизации.

Третья предложенная теория подавления ионов в ESI связана с наличием энергонезависимый частицы, которые могут либо вызывать соосаждение аналита в капле (таким образом, предотвращая ионизацию), либо предотвращать сокращение размера капли до критического радиуса, необходимого для механизмов испарения ионов и / или остатков заряда для эффективного образования ионов газовой фазы.

Стоит учитывать, что степень подавления ионов может зависеть от концентрации контролируемого аналита. Более высокое соотношение аналит / матрица может снизить эффект подавления ионов.^[7]

Оценка ионного подавления во время валидации метода

Поскольку считается, что подавление ионов может влиять на другие аналитические параметры любого анализа, разумный подход к разработке любого метода ЖХ-МС должен включать оценку подавления ионов. Есть два принятых протокола, с помощью которых это может быть достигнуто, описанные ниже.

Мониторинг реакции детектора при постоянной инфузии

Более комплексный подход к оценке подавления ионов состоит в том, чтобы постоянно вводить соответствующую концентрацию в поток подвижной фазы после аналитической колонки с помощью шприцевого насоса и тройника. Затем следует ввести типичный образец через ВЭЖХ вход в соответствии с обычными аналитическими параметрами.

Мониторинг реакции детектора во время этого эксперимента должен давать постоянный сигнал, соответствующий концентрации введенных видов. После того, как образец был введен, падение интенсивности сигнала (или отрицательный ответ) должно наблюдаться каждый раз, когда компонент ионизируется в ионном источнике. Это должно позволить определить время удерживания любого такого вида при аналитических параметрах анализа. Любые виды, вызывающие отрицательный ответ, могут рассматриваться как способствующие подавлению ионов, но только если такие виды совместноэлюировать с интересующим аналитом.

Также важно учитывать, что частицы, способствующие подавлению ионов, могут удерживаться колонкой в гораздо большей степени, чем интересующий аналит. С этой целью реакцию детектора следует контролировать в несколько раз больше обычного времени хроматографического анализа, чтобы гарантировать, что подавление ионов не повлияет на последующие вводы.

Подготовка образцов плазмы с добавками

Другой подход к оценке подавления ионов - это сравнение между:

Отклик детектора калибровочного стандарта (водного или другого подходящего растворителя) - это дает наилучший сценарий для отклика детектора, то есть в условиях нулевого подавления ионов.
Предварительно подготовленная матрица образца с идентичной концентрацией аналита - это демонстрирует эффект подавления ионов
Отклик детектора матрицы пробы, содержащей идентичную концентрацию аналита и подвергнутую обычной процедуре подготовки пробы - это может продемонстрировать разницу между любой потерей сигнала из-за недостаточного восстановления во время процесса подготовки пробы и истинным подавлением ионов

Подходы к отрицанию ионного подавления

Существует несколько стратегий устранения и / или отрицания подавления ионов. Эти подходы могут потребовать глубокого понимания механизмов ионизации, участвующих в различных источники ионизации или может быть полностью независимым от задействованных физических факторов.

Хроматографическое разделение

Если хроматографическое разделение может быть изменено для предотвращения соэлюции подавляющих веществ, тогда нет необходимости рассматривать другие подходы. Эффект хроматографической модификации можно оценить с помощью мониторинга отклика детектора при подходе постоянной инфузии, описанном ранее.

Базовые приготовления

Эффективный протокол подготовки проб, обычно включающий либо жидкость-жидкостная экстракция (LLE) или твердофазная экстракция (SPE) и часто дериватизация может удалить частицы, подавляющие ионы, из матрицы образца перед анализом. Эти общие подходы могут также удалить другие помехи, такие как изобарические виды.

Осаждение белков это еще один метод, который можно использовать для анализа малых молекул. Удаление всех видов белка из матрицы образца может быть эффективным в некоторых случаях, хотя для многих аналитов виды, подавляющие ионы, не имеют белкового происхождения, поэтому этот метод часто используется в сочетании с экстракцией и дериватизацией.

Концентрация пробы и расход подвижной фазы

Разбавление пробы или уменьшение объема вводимой пробы может привести к снижению подавления ионов за счет уменьшения количества присутствующих мешающих частиц, хотя количество представляющего интерес аналита также будет уменьшено, что делает этот подход нежелательным для анализа следов.

Сходным является эффект уменьшения скорости потока подвижной фазы до диапазона нанолитров в минуту, поскольку, помимо улучшения десольватации, образующиеся капли меньшего размера более устойчивы к присутствию нелетучих частиц в матрице образца.

Методы калибровки для компенсации ионного подавления

Не всегда удается устранить ионное подавление пробоподготовкой и / или хроматографическим разрешением. В таких случаях можно компенсировать влияние ионного подавления на точность и прецизионность (но не на аналитическую чувствительность) путем принятия сложных стратегий калибровки.

Матричные калибровочные стандарты

Использование калибровочных стандартов, согласованных с матрицей, может компенсировать подавление ионов. Используя этот метод, калибровочные стандарты готовятся в матрице образца, идентичной матрице, используемой для анализа (например, плазма), путем добавления в нормальный образец известных концентраций аналита. Это не всегда возможно для биологических образцов, поскольку интересующий аналит часто эндогенно присутствует в клинически значимом, хотя и нормальном количестве. Чтобы калибровочные стандарты, согласованные с матрицей, эффективно компенсировали ионное подавление, матрица пробы не должна содержать интересующего аналита. Кроме того, важно, чтобы состав исследуемого образца был небольшим, так как и тестовый образец, и подготовленный калибровочный образец должны подвергаться одинаковому воздействию ионного подавления. Опять же, в сложных биологических образцах от разных людей или даже от одного и того же человека в разное время могут наблюдаться большие колебания концентраций веществ, подавляющих ионы.

Стандартное дополнение

Стандартный подход к добавлению включает добавление в один и тот же экстракт пробы нескольких известных концентраций аналита. Этот метод более надежен и эффективен, чем использование стандартов, согласованных с матрицей, но является трудоемким, так как каждый образец необходимо готовить несколько раз для достижения надежной калибровки.

Внутренний стандарт

При таком подходе в образец добавляется вид (внутренний стандарт ), который используется для нормализации реакции аналита, компенсации переменных на любом этапе подготовки и анализа пробы, включая подавление ионов.

Важно, чтобы внутренний стандарт демонстрировал очень похожие (идеально идентичные) свойства в отношении отклика детектора (то есть ионизации) в качестве интересующего аналита. Чтобы упростить выбор внутреннего стандарта, большинство лабораторий используют аналогичный стабильный изотоп в изотопное разбавление типовой анализ. Практически гарантировано, что стабильный изотоп химически и физически максимально близок к интересующему аналиту, что дает почти идентичный отклик детектора в дополнение к идентичному поведению во время подготовки образца и хроматографического разрешения. С этой целью подавление ионов, испытываемое как аналитом, так и внутренним стандартом, должно быть идентичным. Важно отметить, что чрезмерно высокая концентрация внутреннего стандарта стабильного изотопа может вызвать само подавление ионов, так как он будет элюироваться вместе с исследуемым аналитом. Следовательно, внутренний стандарт следует добавлять в соответствующей концентрации.

Выбор источника ионизации

APCI обычно страдает меньшим ионным подавлением, чем ESI, как обсуждалось ранее. Если возможно, если подавление ионов неизбежно, рекомендуется переключиться с ESI на APCI. Если это невозможно, может быть полезно переключить режим ионизации ESI с положительного на отрицательный. Поскольку в режиме отрицательной ионизации ионизируется меньшее количество соединений, вполне возможно, что компоненты, подавляющие ионы, могут быть удалены из анализа. Однако следует также учитывать, что интересующий аналит не может быть эффективно ионизирован и в отрицательном режиме, что делает этот подход бесполезным.