ICLIP - iCLIP

iCLIP[1] (Перекрестное связывание и иммунопреципитация с разрешением отдельных нуклеотидов) - это метод, используемый для идентификации взаимодействий белок-РНК. Метод использует УФ-излучение для ковалентного связывания белков и молекул РНК. Этот сшивание шаг обычно имеет меньший фон, чем Иммунопреципитация РНК протоколы.[2][3] Как и все ЗАЖИМ методы, iCLIP позволяет проводить очень строгую очистку связанных комплексов белок-РНК, используя иммунопреципитацию с последующей SDS-СТРАНИЦА и переход на нитроцеллюлозу. Затем радиоактивно меченые комплексы белок-РНК вырезают из нитроцеллюлозы и обрабатывают протеиназой для высвобождения РНК, оставляя одну или две аминокислоты в месте сшивания РНК.

Затем РНК подвергается обратной транскрипции, в результате чего кДНК часто усекаются в месте перекрестной сшивки, что является ключевым моментом и уникальной особенностью при разработке iCLIP, поскольку позволяет идентифицировать сайт взаимодействия РНК-белок с высоким разрешением. Аналогичное разрешение можно получить со стандартным ХИТС-КЛИП методы, используя наблюдение, что ОТ, которая действительно считывает сайт перекрестной связи, имеет высокий уровень ошибок, что может быть использовано для определения положения перекрестной связи (анализ «сайта мутации, индуцированной перекрестными связями» (CIMS)[4]).

Небольшое количество полученных кДНК затем амплифицируют с помощью ПЦР и секвенируют с использованием платформы для секвенирования следующего поколения. Праймер, используемый для обратной транскрипции, может содержать случайную последовательность, которую можно использовать для штрих-кодирования кДНК. Это помогает идентифицировать эффекты чрезмерной амплификации ПЦР на этапе высокопроизводительного секвенирования и, следовательно, улучшает количественную оценку событий связывания.

Рекомендации

  1. ^ Кениг, Джулиан; Зарнак, Кэти; Luscombe, Николас М .; Уле, Ерней (18 января 2012 г.). «Взаимодействия белок – РНК: новые геномные технологии и перспективы». Природа Обзоры Генетика. 13 (2): 77–83. Дои:10.1038 / nrg3141. ЧВК  4962561. PMID  22251872.
  2. ^ Яо, Чэнго; Вэн, Линцзе; Ши, Юншэн (20 февраля 2014 г.). «Глобальное картирование взаимодействия белок-РНК при разрешении одного нуклеотида с помощью iCLIP-seq». Методы молекулярной биологии. 1126: 399–410. Дои:10.1007/978-1-62703-980-2_27. ЧВК  4412157. PMID  24549678.
  3. ^ Гуппертц, Инна; Аттиг, Ян; Д'Амброджо, Андреа; Истон, Лаура Э; Сибли, Кристофер Р.; Сугимото, Ёитиро; Тайник, Мойца; Кениг, Джулиан; Уле, Ерней (февраль 2014 г.). «iCLIP: взаимодействия белок-РНК при разрешении нуклеотидов». Методы. 65 (3): 274–87. Дои:10.1016 / j.ymeth.2013.10.011. ЧВК  3988997. PMID  24184352.
  4. ^ Чжан, Чаолинь; Дарнелл, Роберт Б. (1 июня 2011 г.). «Картирование взаимодействий белок-РНК in vivo при разрешении одного нуклеотида из данных HITS-CLIP». Природа Биотехнологии. 29 (7): 607–614. Дои:10.1038 / nbt.1873. ЧВК  3400429. PMID  21633356.