Репортерская система GUS - GUS reporter system

Пыльники риса и стиль, показывающий выражение GUS

В Репортерская система GUS (GUS: β-глюкуронидаза ) это репортерный ген система, особенно полезная для растений молекулярная биология[1] и микробиология.[2] Несколько видов GUS анализ репортерного гена доступны в зависимости от используемого субстрата. Период, термин Окрашивание GUS относится к наиболее распространенному из них - гистохимическому методу.

Цель

Цель этой методики - проанализировать активность промоутер (с точки зрения выражение гена под этим промотором) либо количественно, либо путем визуализации его активности в различных ткани. В методике используется ген uidA кишечная палочка, который кодирует фермент, β-глюкуронидаза;[3] этот фермент при инкубации с некоторыми специфическими бесцветными или нефлуоресцентными субстраты, может превратить их в цветной или же флуоресцентный товары.[4]

Ген uidA можно гибридизировать с представляющим интерес геном, создавая слияние генов. Встраивание гена uidA вызовет продукцию GUS, которую затем можно обнаружить с использованием различных глюкуронидов в качестве субстратов.[4]

Субстраты

Возможны разные глюкурониды которые могут использоваться в качестве субстратов для β-глюкуронидазы, в зависимости от типа необходимого обнаружения (гистохимический, спектрофотометрический, флуориметрический ). Наиболее распространенным субстратом для гистохимического окрашивания GUS является 5-бром-4-хлор-3-индолил глюкуронид (X-Gluc ). X-Gluc - это гидролизованный посредством GUS, который образует 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго (диХ-индиго). DiX-индиго будет синим, и его можно будет увидеть с помощью светового микроскопа.[5] Этот процесс аналогичен гидролизу X-gal к Бета-галактозидаза.[5]

Для других типов обнаружения распространенными субстратами являются: п-нитрофенил β-D-глюкуронид для спектрофотометрического анализа и 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкуронид (MUG) для флуориметрического анализа.[6]

История

Система была первоначально разработана Ричард Энтони Джефферсон во время его Кандидат наук. на Колорадский университет в Боулдере.[7] Он адаптировал технику для использования с растениями, когда работал в Институт селекции растений из Кембридж, между 1985 и 1987 гг.[1] С тех пор эту систему использовали тысячи лабораторий, что сделало ее одним из наиболее широко используемых инструментов в молекулярной биологии растений, о чем свидетельствуют более 6000 ссылок в научной литературе.[7]

Целевые организмы

Эмбрион риса с выражением GUS

Организм подходит для анализа GUS, если он не имеет β-глюкуронидазы или если активность очень низкая (фон Мероприятия). По этой причине анализ в большинстве случаев бесполезен. позвоночные и много моллюски.[6] Поскольку в высшие растения, мхи, водоросли, папоротники, грибы и большинство бактерии,[6] анализ идеально подходит для этих организмов.

Окрашивание с помощью GUS-системы на Arabidopsis thaliana

Таким образом, он широко используется в растениеводстве.

Преимущества и ограничения

Анализ GUS не требует присутствия каких-либо кофакторов или ионов для функционирования. Бета-глюкуронидаза может функционировать в широком диапазоне значений pH и довольно устойчива к термической инактивации. [8] Однако GUS чувствителен к ингибированию со стороны определенных ионов тяжелых металлов, таких как Cu2+ и Zn2+.

Кроме того, интерпретация анализа ограничена перемещением diX-indigo по клетке. DiX-индиго может ассоциироваться с липидами и диффундировать далеко от места активности фермента, что свидетельствует об отсутствии цитозольной локализации и неравномерности проникновения субстрата. Это потенциально может привести к неправильной интерпретации локализации GUS-белка.[9] Несмотря на отсутствие клеточной локализации, ядерная локализация GUS хорошо наблюдалась. [10] Анализы GUS можно проводить в присутствии феррицианид калия чтобы пятно не распространилось.[5]

Другие репортерные системы

Система GUS - не единственная доступная система-репортер генов для анализа активности промоторов. Другие конкурирующие системы основаны, например, на люцифераза, GFP, бета-галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза (КОТ), щелочная фосфатаза. Использование той или иной системы в основном зависит от интересующего организма.

Другое использование

Слой алейронов семян риса, показывающий экспрессию GUSPlus

Анализ GUS, как и другие системы репортерных генов, можно использовать для других видов исследований, кроме классического анализа активности промотора. Репортерные системы использовались для определения эффективности систем доставки генов, внутриклеточной локализации генного продукта, обнаружения взаимодействий белок-белок или белок-ДНК, эффективности сигналов инициации трансляции и успеха усилий по молекулярному клонированию.

Источники

  1. ^ а б Джефферсон, Р.А.; Kavanagh, T. A .; Беван, М.В. (1987). «Слияние GUS: бета-глюкуронидаза как чувствительный и универсальный маркер слияния генов у высших растений». Журнал EMBO. 6 (13): 3901–7. Дои:10.1002 / j.1460-2075.1987.tb02730.x. ЧВК  553867. PMID  3327686.
  2. ^ Ванде Брук, А; Lambrecht, M; Вандерлейден, Дж (1998). «Бактериальная хемотаксическая подвижность важна для инициации колонизации корней пшеницы Azospirillum brasilense». Микробиология. 144 (9): 2599–606. Дои:10.1099/00221287-144-9-2599. PMID  9782509.
  3. ^ Бланко, К; Ritzenthaler, P; Мата-Гилсингер, М. (1982). «Клонирование и эндонуклеазный рестрикционный анализ генов uidA и uidR в Escherichia coli K-12: определение направления транскрипции для гена uidA». Журнал бактериологии. 149 (2): 587–94. Дои:10.1128 / JB.149.2.587-594.1982. ЧВК  216546. PMID  6276362.
  4. ^ а б Джефферсон, Р. А .; Берджесс, С. М .; Хирш, Д. (1986). «Бета-глюкуронидаза из Escherichia coli как маркер слияния генов». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 83 (22): 8447–51. Bibcode:1986PNAS ... 83.8447J. Дои:10.1073 / pnas.83.22.8447. ЧВК  386947. PMID  3534890.
  5. ^ а б c Guivarc'h, A .; Caissard, J. C .; Азми, А .; Эльмаян, Т .; Chriqui, D .; Тепфер, М. (1996-09-01). «Обнаружение in situ экспрессии репортерного гена thegus в трансгенных растениях: десять лет генов синего». Трансгенные исследования. 5 (5): 281–288. Дои:10.1007 / BF01968938. ISSN  1573-9368.
  6. ^ а б c Патент США 5268463
  7. ^ а б Камбия Сайт организации: биография Ричарда А. Джефферсона
  8. ^ Джефферсон, Ричард А. (1987-12-01). «Анализ химерных генов в растениях: система слияния генов GUS». Репортер по молекулярной биологии растений. 5 (4): 387–405. Дои:10.1007 / BF02667740. ISSN  1572-9818.
  9. ^ Кессар, Жан-Клод; Гиварч, Энн; Рембур, Жак; Азми, Абделькрим; Чрики, Доминик (1994-05-01). «Ложные локализации микрокристаллов diX-индиго, полученные с помощью гистохимического анализа GUS». Трансгенные исследования. 3 (3): 176–181. Дои:10.1007 / BF01973985. ISSN  1573-9368.
  10. ^ Цитовский, В .; Zupan, J .; Warnick, D .; Замбрыски, П. (1992-06-26). «Ядерная локализация белка Agrobacterium VirE2 в клетках растений». Наука. 256 (5065): 1802–1805. Дои:10.1126 / science.1615325. ISSN  0036-8075. PMID  1615325.