Дифференциальное центрифугирование - Differential centrifugation

Дифференциальное центрифугирование

Дифференциальное центрифугирование (также известен как центрифугирование с дифференциальной скоростью) - обычная процедура в биохимия и клеточная биология, который используется для разделения органеллы и другие субклеточные частицы на основе их скорость осаждения. Хотя дифференциальное центрифугирование часто применяется в биологическом анализе, оно является общим методом, также подходящим для грубой очистки неживых взвешенных частиц (например, наночастицы, коллоидный частицы вирусы ). В типичном случае, когда дифференциальное центрифугирование используется для анализа биологических явлений клетки (например, распределения органелл), ткань образец первый лизированный сломать клеточные мембраны и высвободить органеллы и цитозоль. Затем лизат подвергается повторной центрифугирование, где частицы, которые достаточно быстро осаждаются при заданной центробежной силе в течение заданного времени, образуют компактный «осадок» на дне пробирки для центрифугирования.^[1]

После каждого центрифугирования супернатант (непосадочный раствор) удаляют из пробирки и повторно центрифугируют при повышенном центробежная сила и / или время. Дифференциальное центрифугирование подходит для разделения сырой нефти на основе скорости осаждения, но более мелкозернистая очистка может проводиться на основе плотности через центрифугирование в равновесном градиенте плотности.^[2] Таким образом, метод дифференциального центрифугирования представляет собой последовательное осаждение частиц из предыдущего супернатанта с использованием все более высоких сил центрифугирования.^[3] Клеточные органеллы, разделенные дифференциальным центрифугированием, поддерживают относительно высокую степень нормального функционирования до тех пор, пока они не подвергаются денатурирующим условиям во время выделения.^[4][5]

Теория

В вязкой жидкости ставка из осаждение данной взвешенной частицы (при условии, что частица более плотная, чем жидкость) в значительной степени зависит от следующих факторов:

• Сила гравитации
• Разница в плотности
• Вязкость жидкости
• Размер и форма частиц

Более крупные частицы осаждаются быстрее и при меньших центробежных силах. Если частица менее плотная, чем жидкость (например, жиры в воде), частица не будет осаждаться, а скорее будет плавать, независимо от силы перегрузки, испытываемой частицей. Центробежная сила разделяет компоненты не только по плотности, но также по размеру и форме частиц. Напротив, более специализированный центрифугирование в равновесном градиенте плотности обеспечивает профиль разделения, зависящий только от плотности частиц, и поэтому подходит для более мелкозернистого разделения.

Высокая перегрузка делает осаждение мелких частиц намного быстрее, чем Броуновский распространение, даже для очень мелких (наноразмерных) частиц. Когда используется центрифуга, Закон Стокса необходимо изменить, чтобы учесть изменение силы тяжести с расстоянием от центра вращения.^[6]

${\displaystyle D={\sqrt {\frac {18\eta \,\ln(R_{f}/R_{i})}{(\rho _{p}-\rho _{f})\omega ^{2}t}}}}$

куда

• D - минимальный диаметр частиц, которые, как ожидается, осаждаются (м)
• η (или µ) - жидкость динамическая вязкость (Па.с)
• р_ж это последний радиус вращения (м)
• р_я - начальный радиус вращения (м)
• ρ_п объемная массовая плотность частиц (кг / м³)
• ρ_ж объемная массовая плотность жидкости (кг / м³)
• ω - это угловая скорость (радиан / с)
• t - время, необходимое для осаждения из R_я к R_ж (s)

Процедура

Дифференциальное центрифугирование можно использовать с интактными частицами (например, биологическими клетками, микрочастицами, наночастицами) или использовать для разделения составных частей данной частицы.^[7] Используя пример отделения эукариотических органелл от интактных клеток, клетка должна быть сначала лизирована и гомогенизированный (в идеале с помощью щадящей техники, такой как гомогенизация dounce; более жесткие методы или чрезмерная гомогенизация приведут к снижению доли неповрежденных органелл). После получения неочищенного экстракта органелл его можно подвергнуть центрифугированию с различными скоростями для разделения органелл:

Типичные параметры дифференциального центрифугирования для биологического образца^[2] (длина пути центрифугирования ≈1–5 см)

Пример ввода	G сила	Время	Необходим инструмент	Содержание пеллет	Содержание супернатанта
Нелизированные (эукариотические) клетки	100 х г	5 минут	Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным ковшом	Интактные (эукариотические) клетки, макроскопический мусор	Зависит от образца
Аккуратно лизированные клетки (например, гомогенизатор Даунса)	600 х г	10 минут	Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным ковшом	Ядра	Цитозоль, ненядерные органеллы
Супернатант предыдущего ряда	15000 х г	20 мин	Настольная центрифуга с фиксированным углом	Митохондрии, хлоропласты, лизосомы, пероксисомы	Цитозоль, микросомы (известный как пост-митохондриальный супернатант)
Супернатант предыдущего ряда	50,000 х г - 100,000 х г	60 мин	Высокоскоростная центрифуга с фиксированным углом или вакуумная ультрацентрифуга	Плазматическая мембрана, микросомальная фракция, большие полирибосомы	Цитозоль, рибосомальные субъединицы, малые полирибосомы, ферментные комплексы
Супернатант предыдущего ряда	50,000 х г - 100,000 х г	120 мин	Вакуумная ультрацентрифуга	Рибосомные субъединицы, небольшие полирибосомы, некоторые растворимые ферментные комплексы	Цитозоль

Ультрацентрифугирование

Теперь лизированный образец готов к центрифугированию в ультрацентрифуга. Ультрацентрифуга состоит из охлаждаемой камеры низкого давления, содержащей ротор, который приводится в движение электродвигателем, способным к высокоскоростному вращению. Образцы помещают в пробирки внутри ротора или прикрепляют к нему. Скорость вращения может достигать 100 000 об / мин для напольной модели, 150 000 об / мин для настольной модели (Beckman Optima Max-XP или Sorvall MTX150), создавая центробежные силы скорости от 800 000 до 1 000 000 g. Эта сила вызывает осаждение макромолекул, и может даже вызвать неравномерное распределение небольших молекул.^[8]

Поскольку разные фрагменты клетки имеют разные размеры и плотность, каждый фрагмент будет оседать в осадок с разными минимальными центробежными силами. Таким образом, разделение образца на разные слои может быть выполнено путем сначала центрифугирования исходного лизата при слабых силах, удаления осадка и последующего воздействия на последующие супернатанты последовательно большего центробежного поля. Каждый раз порция разной плотности оседает на дно контейнера и извлекается, а повторное нанесение создает ряд слоев, включающих различные части исходного образца. Могут быть предприняты дополнительные шаги для дальнейшей очистки каждой из полученных гранул.

Осаждение зависит от массы, формы и частичный удельный объем макромолекулы, а также плотность растворителя, размер ротора и скорость вращения. Скорость седиментации можно контролировать во время эксперимента для расчета молекулярный вес.Ценности коэффициент седиментации (S) можно вычислить. Большие значения S (более высокая скорость седиментации) соответствуют большей молекулярной массе. Плотные частицы осаждаются быстрее. Удлиненные белки имеют больший коэффициент трения и медленнее осаждаются для обеспечения точности.^[9]

Различия между дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в градиенте плотности

Разница между методами дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности заключается в том, что в последнем методе используются растворы различной плотности (например, сахароза, фиколл) или гели, через которые проходит образец. Это разделяет образец на слои по относительной плотности, основываясь на том принципе, что молекулы оседают под действием центробежной силы, пока не достигнут среды с такой же плотностью, как у них.^[10] Степень разделения или количество слоев зависит от раствора или геля. Дифференциальное центрифугирование, с другой стороны, не использует градиент плотности, и центрифугирование происходит с возрастающей скоростью. Различная скорость центрифугирования часто приводит к разделению не более чем на две фракции, поэтому супернатант может быть разделен на дополнительных этапах центрифугирования. Для этого на каждом этапе скорость центрифугирования необходимо увеличивать до тех пор, пока не будут отделены желаемые частицы. Напротив, центрифугирование в градиенте плотности обычно выполняется только с одной скоростью центрифугирования.^[11]

Смотрите также

• Ультрацентрифугирование с плавучестью
• Жером Виноград

Рекомендации

1. Олендик, Кей; Хардинг, Стивен Э. (19 апреля 2018 г.). «Центрифугирование и ультрацентрифугирование». Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии Уилсона и Уокера: 424–453. Дои:10.1017/9781316677056.014. ISBN  9781107162273.
2. Дарнелл, Джеймс; Балтимор, Дэвид; Мацудаира, Пол; Зипурский, С. Лоуренс; Берк, Арнольд; Лодиш, Харви (2000). «Очистка клеток и их частей».
3. Гриффит, Оуэн Митч (2010). Практические методы центробежного разделения - Руководство по применению (PDF). Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. п. 1-27.
4. Джеральд Карп (19 октября 2009 г.). Клеточная и молекулярная биология: концепции и эксперименты. Джон Вили и сыновья. С. 28–. ISBN  978-0-470-48337-4.
5. Лившиц Михаил А .; Хомякова, Елена; Евтушенко Евгений Г .; Лазарев, Василий Н .; Кулемин, Николай А .; Семина, Светлана Е .; Генерозов, Эдуард В .; Говорун, Вадим М. (30 ноября 2015 г.). «Выделение экзосом с помощью дифференциального центрифугирования: теоретический анализ широко используемого протокола». Научные отчеты. 5 (1): 17319. Bibcode:2015НатСР ... 517319Л. Дои:10.1038 / srep17319. ISSN  2045-2322. S2CID  14200669.
6. Harding, Стивен Э .; Скотт, Дэвид; Роу, Артер (16 декабря 2007 г.). Аналитическое ультрацентрифугирование: методы и методы. Королевское химическое общество. ISBN  978-1-84755-261-7.
7. Фрей, Марк. «Центрифугирование разделения». БиоФайлы. 6 (5): 6–7.
8. Тейлор, Дуглас Д .; Шах, Сахил (1 октября 2015 г.). «Методы выделения внеклеточных везикул влияют на последующий анализ их грузов». Методы. 87: 3–10. Дои:10.1016 / j.ymeth.2015.02.019. PMID  25766927.
9. Вэнс, Деннис Э .; Вэнс, Дж. Э. (6 августа 1996 г.). «Структура, сборка и секреция липопротеинов». Биохимия липидов, липопротеинов и мембран. Эльзевир. ISBN  978-0-08-086092-3.
10. Сапкота, Анупама (3 сентября 2020 г.). «Типы центрифуг и центрифугирования (определение, принцип, использование)». Заметки о микробах.
11. Ю, Ли-Ли; Чжу, Цзин; Лю, Цзинь-Ся; Цзян, Фэн; Ни, Вен-Кай; Цюй Ли-Шуай; Ни, Рун-Чжоу; Лу, Цуй-Хуа; Сяо, Мин-Бин (2018). «Сравнение традиционных и новых методов отделения экзосом от образцов человека». BioMed Research International. 2018: 1–9. Дои:10.1155/2018/3634563. ЧВК  6083592. PMID  30148165.