Кротоксин - Crotoxin

Кротоксин (CTX) является основным токсичным соединением в Змеиный яд южноамериканской гремучей змеи, Crotalus durissus потрясающий. Кротоксин представляет собой гетеродимерный бета-нейротоксин, состоящий из кислой, нетоксичной и неферментативной субъединицы (СА) и основного, слаботоксичного, фосфолипаза А2 белок (CB). Этот нейротоксин вызывает паралич за счет пре- и постсинаптического блокирования ацетилхолин сигнализация.

История

Кротоксин был идентифицирован в 1938 году исследователями химического факультета Минздрава России. Instituto Butantan в Сан-Паулу. Сначала соединение было очищено от яда Crotalus d. потрясающий. Эти исследователи обнаружили, что 60 процентов яда состояло из нейротоксического вещества, позже названного кротоксином.[1]

Кротоксин был первым кристаллизованным белковым токсином (Кристаллизация белка ). Первая публикация этого открытия уже доказала, что токсин работает с двумя элементами: токсичным и коагулирующим.[1] Позже было обнаружено, что белок кротоксин не однороден, а состоит из 2 субъединиц. Токсический эффект кротоксина определяется главным образом действием фосфолипазы A2 CB. Субъединица СА неферментативна и нетоксична, но выполняет функции свертывания крови (Коагуляция ), теперь известный как кротапотин.[2][3]С 1966 года по сегодняшний день проводятся исследования фармакологического применения кротоксина.[4][5]

Структура и реакционная способность

Структура кротоксина состоит из компонентов CA и CB в молекулярном соотношении 1: 1. CA - это нетоксичный и неферментативный кислый белок, в то время как CB - токсичный компонент, белок фосфолипазы A2. Оба компонента образуют нековалентный гетеродимерный комплекс (Димер белка ). Было обнаружено, что изоформы (Изоформа белка ) CA и CB могут образовывать по крайней мере 16 различных комплексов CTX.[3]

Субъединица СА

Белок СА образован тремя дисульфид -связанные полипептидные цепи: α, β и γ. Альфа-спирали (Альфа-спираль ) с петлями в концевых положениях образованы цепями α и β. Цепь γ образует неупорядоченную петлю. Компонент CA присутствует в гетеродимерном комплексе для предотвращения связывания фосфолипазы A2 с неспецифическими сайтами связывания.[3]

Подразделение CB

Субъединица CB представляет собой белок фосфолипазы A2. C-терминал (C-конец ) субъединицы CB важен для взаимодействия между обеими субъединицами, поскольку он взаимодействует с альфа-спиралью CA. Таким образом, субъединица СА блокирует часть поверхности фермента фосфолипазы А2, что приводит к невозможности ее активации. Это означает, что фосфолипаза А2 не может адсорбироваться на границе раздела липид / вода с клеточной мембраны. Остатки на субъединице CB, которые вовлечены в поверхность фермента и блокируются субъединицей CA, представляют собой F24 и F119, которые являются фенилаланин аминокислоты. Однако было обнаружено, что эти остатки не входят в состав активный сайт.[6]

Интерфейс между CA и CB образован тремя триптофан аминокислоты, которые играют важную роль в стабильности кротоксинового комплекса.[3]

Реактивность

Различные изоформы обеих субъединиц CA и CB могут образовывать комплексы кротоксинов, которые можно подразделить на два класса: умеренно токсичные с высокой активностью фосфолипазы А2 или более токсичные с более низкой ферментативной активностью. Таким образом, изоформы также играют роль в стабильности кротоксинового комплекса. Менее токсичные комплексы менее стабильны, тогда как более токсичные комплексы более стабильны. Поэтому более токсичные комплексы кротоксинов диссоциируют медленнее, чем менее токсичные. Связь между токсичностью и ферментативной активностью является результатом синергетического действия (Синергия ) действия обеих субъединиц. Для этого субъединица CA увеличивает токсичность субъединицы CB, снижая при этом ее ферментативную активность и антикоагулянтную активность.[7][8][9]

Механизм действия

Основное механическое действие кротоксина двоякое: пресинаптическое и постсинаптическое.[10][11]

Пресинаптический

Ингибирование пресинаптической секреции ацетилхолина вызвано активностью фосфолипазы A2 субъединицы CB. Точный механизм пресинаптического ингибирования ацетилхолина фосфолипазой A2 (PLA2) не известен. Хотя пресинаптический эффект вызывается субъединицей CB, он усиливается за счет присутствия субъединицы CA.[12]

Гипотезы

Есть несколько гипотез и моделей, которые пытаются объяснить фармакологические эффекты активности фосфолипазы A2 (PLA2).

Существует гипотеза, основанная на повреждении, которое PLA2 наносит мембранным фосфолипидам посредством гидролиза в специфических сайтах связывания на экзоцитотически активных частях мембраны. Это может привести к вмешательству в реабсорбцию пузырьки и истощение запасов ацетилхолина.[13] Другая гипотеза основана на специфическом связывании с рецепторами и белками для создания внутриклеточных фермент-зависимых и независимых реакций. Повреждение мембраны активностью PLA2 позволяет PLA2 проникать в клетки и специфически связываться с белками и рецепторами, агонистическими или антагонистическими, вызывая неферментативные фармакологические эффекты. Внутриклеточный PLA2 также может оставаться ферментативно активным и гидролизовать фосфолипиды мембран. Это может привести к фармакологическому эффекту из-за повреждения мембран и мембранных белков или лизофосфолипидов и жирные кислоты высвобождается при гидролизе.[14] Окончательная гипотеза основана на индуцированных изменениях концентрации Ca2 + в пораженных клетках. Сильные изменения концентраций Ca2 + мешают многим процессам, включая слияние пузырьков и потенциал митохондриальной мембраны. Оба эти процесса важны для гомеостаза ацетилхолина.[15]

Постсинаптический

Вторая часть механизма действия кротоксина - постсинаптическая часть. Постсинаптический никотиновые рецепторы ацетилхолина блокируются гетеродимерной формой кротоксина. Это блокирование достигается за счет стабилизации неактивной формы никотиновых рецепторов ацетилхолина ферментным комплексом. Этот постсинаптический эффект вместе с пресинаптическим ингибированием ацетилхолина может привести к параличу пораженных мышц.[11]

Токсичность

Кротоксин имеет фатальные нейротоксические эффекты, поскольку токсичность CB синергетически усиливается CA.[16][17]Многие люди умирают от острой почечной недостаточности или острой дыхательной недостаточности. Последнее является результатом паралича мышц дыхательной системы.[18] Низкий уровень кротоксина приводит к неполной блокаде рецептора ацетилхолина, что приводит к парезу, который полностью обратим. При более высоких дозах нервно-мышечные нарушения становятся более серьезными. Также другие холинергический симптомы обычны, особенно при высоких дозах. Внутримышечная инъекция кротоксина также демонстрирует миотоксические эффекты.[19] Внутривенный LD50 (Средняя смертельная доза ) нативного кротоксина у мышей составляет 0,096 мкг / г.[20] Сообщалось, что у мышей может развиться толерантность к токсину, когда они получают увеличивающиеся дозы кротоксина каждый день. В конечном итоге они могут переносить дозы, в 35 раз превышающие LD50, без интоксикации.[21] Доклинические исследования на людях также показывают, что признаки токсичности уменьшались или исчезали, когда пациенты подвергались воздействию кротоксина в течение более длительных периодов времени.[19]

Уход

В Бразилии ежегодно около 2000 укусов змей происходят из-за Crotalus durissus. Единственное лечение для людей, отравленных C. durissus представляет собой специально разработанное противоядие, которое необходимо вводить внутривенно. С появлением этого противоядия уровень смертности снизился с 73% до 1,5%. Дозировка противоядия варьируется от 10 до 20 ампул в зависимости от тяжести отравления. Однако эффективность доз клинически не исследовалась.[18]

Эффективность

Кротоксин в C. durissus яд - мощный нейротоксин, который также вызывает почечные и миотоксические эффекты. Помимо токсических эффектов, кротоксин также проявляет противовоспалительное, иммуномодулирующее, анти-ВИЧ и противоопухолевое действие на моделях человека и животных.[4]Вместе с тем фактом, что организм может выработать толерантность к токсическим эффектам кротоксина, эти эффекты представляют интерес для фармацевтического применения.[19][22]

Фармацевтические приложения

Поскольку кротоксин действует как нейромышечный блокатор (Нервно-мышечный блокатор ), уже были проведены некоторые исследования, чтобы выяснить, может ли кротоксин действовать в качестве терапии при проблемах с мышечным напряжением.[23] В одном исследовании было показано, что кротоксин улучшает выравнивание глаз у группы пациентов с косоглазием после инъекции. То же исследование также показало, что это может помочь пациентам, страдающим от блефароспазм.[23] При низких концентрациях кротоксина пациенты с мышечной дистонии показать нормальную функцию. Поэтому предлагается как хорошая альтернатива для ботулинический токсин.[24] Клинические исследования показали, что комплекс кротоксинов и изолированный CB имеют антигенные характеристики, которые могут стимулировать антитело производство. Некоторые исследования показали, что кротоксин улучшает симптомы, связанные с иммунными заболеваниями и другими состояниями, в том числе: рак.[25] Однако в настоящее время нет NCI (Национальный институт рака ) поддержал клинические испытания по изучению кротоксина для лечения рака.[26]

Рекомендации

  1. ^ а б Слотта, К. Х., Френкель-Конрат Х. «Два активных белка из яда гремучей змеи», Природа, 142, 213 (1938). DOI: 10.1038 / 142213a0.
  2. ^ Rübsamen K, Breithaupt H, Habermann E (1971). «Биохимия и фармакология комплекса кротоксинов: I. Субфракционирование и рекомбинация комплекса кротоксинов», Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Pharmakologie, 270, 274-288.
  3. ^ а б c d Фернандес С., Пазин В., Дрейер Т. и др. «Биофизические исследования предполагают новое структурное расположение кротоксина и дают представление о его токсическом механизме», Научные отчеты, 7, 43885 (2017). DOI: 10,1038 / srep43885.
  4. ^ а б Sampaio SC, Hyslop S, Fontes MRM, Prado-Franceschi J, Zambelli VO, Magro AJ, Brigatte P, Gutierrez VP, Cury Y (2010). «Кротоксин: новые действия для классического β-нейротоксина», Токсикон, 55(6), 1045-1060. DOI: 10.1016 / j.toxicon.2010.01.011.
  5. ^ Витал Бразилия и др. (1966). «Фармакология кристаллического кротоксина - токсичность», Memórias do Instituto Butantan, 33, 973-980.
  6. ^ Переанес Дж. А., Гомес И. Д., Патино AC (2012). «Взаимосвязь между структурой и ферментативной активностью комплекса кротоксина и его субъединицы фосфолипазы А2: подход in silico», Журнал молекулярной графики и моделирования, 35, 36-42. DOI: 10.1016 / j.jmgm.2012.01.004.
  7. ^ Фор Дж, Сюй Х, Саул Ф.А. (2011). «Кристаллическая структура кротоксина выявляет ключевые остатки, участвующие в стабильности и токсичности этого мощного гетеродимерного β-нейротоксина», J. Mol. Биол., 412(2), 176-191. DOI: 10.1016 / j.jmb.2011.07.027.
  8. ^ Фор Г., Харви А.Л., Томсон Э., Салиу Б., Радвани Ф., Бон С. (1993). «Сравнение изоформ кротоксина показывает, что стабильность комплекса играет важную роль в его фармакологическом действии», Европейский журнал биохимии, 214(2), 491-496. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1993.tb17946.x.
  9. ^ Шуме В., Бушье С., Делот Э, Фор Дж., Салиу Б., Бон С. (1996). «Структура и взаимосвязь функций кротоксина, гетеродимерной нейротоксинфосфолипазы А2 из яда южноамериканской гремучей змеи», В: Singh B.R., Tu A.T. (eds), Natural Toxins 2, Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 391. Springer, Boston, MA.
  10. ^ Вульфиус, Екатерина А. и др. (2017). "Пресинаптически активные фосфолипазы А2 яда поджелудочной железы и змеи ингибируют никотиновые ацетилхолиновые рецепторы", PLOS One, 12(10), DOI: 10.1371 / journal.pone.0186206.
  11. ^ а б Бон, Кассиан и др. (1979). «Постсинаптические эффекты кротоксина и его изолированных субъединиц», Европейский журнал биохимии, 99(3), 471–482. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1979.tb13278.x.
  12. ^ Кавальканте, Вальтер Л. Г. и др. (2017). «Нервно-мышечный паралич, вызванный основной фосфолипазой A 2 субъединицей кротоксина из змеиного яда Crotalus Durissus Terrificus, нуждается в его кислотном шапероне, чтобы одновременно ингибировать высвобождение ацетилхолина и вызывать мышечную блокаду», Токсикология и прикладная фармакология, 334, 8–17. DOI: 10.1016 / j.taap.2017.08.021.
  13. ^ Монтекукко, Чезаре и др. (2009). "Различные механизмы ингибирования нервных окончаний пресинаптическими нейротоксинами ботулина и змеи", Токсикон, 54(5), 561–564. DOI: 10.1016 / j.toxicon.2008.12.012.
  14. ^ Кини, Р. Манджунатха (2003). «Впереди волнение: структура, функция и механизм ферментов фосфолипазы A2 змеиного яда», Токсикон, 42(8), 827–840. DOI: 10.1016 / j.toxicon.2003.11.002.
  15. ^ Ригони, Микела и др. (2007). «Приток кальция и митохондриальные изменения в синапсах, подверженных воздействию нейротоксинов змей или продуктов гидролиза их фосфолипидов», Журнал биологической химии, 282(15), 11238–11245. DOI: 10.1074 / jbc.m610176200.
  16. ^ Лаустсен А.Х. (2016). «Синергизм токсинов в змеином яде», Отзывы о токсинах, 35(3-4), 165-170. DOI: 10.1080 / 15569543.2016.1220397.
  17. ^ Чиунг Чанг К., Донг Ли Дж. (1977). «Кротоксин, нейротоксин яда южноамериканской гремучей змеи, представляет собой пресинаптический токсин, действующий как β-бунгаротоксин», Arch. Pharmacol., 296, 159-168.
  18. ^ а б Amaral CFS, Campolina D, Dias MB, Bueno CM, Chávez-Olortegui C, Penaforte CL, Diniz CR, Rezende NA (1997). «Фактор времени в обнаружении циркулирующего цельного яда и кротоксина и эффективности противоядной терапии у пациентов, отравленных Crotalus durissus», Токсикон, 35(5), 699-704.
  19. ^ а б c Cura JE, Blanzaco DP, Brisson C, Cura MA, Cabrol R, Larrateguy L, Mendez C, Sechi JC, Silveira JS, Theiller E, Roodt AR de, Vidal JC (2002). «Фаза I и исследование фармакокинетики кротоксина (цитотоксин PLA2, NSC-624244) у пациентов с запущенным раком», Клинические исследования рака, 8, 1033-1041.
  20. ^ Magalhaes T, Proietti Viotti A, Teperino Gomes R, Viana de Freitas T (2001). «Влияние состава мембраны и совместного инкапсулирования иммуностимуляторов в кротоксин, захваченный липосомами», Biotechnol. Appl. Biochem., 33, 61-64.
  21. ^ де Араужо Пимента Л., де Алмейда МЧС, Бретонес М.Л. «Кротоксин способствует репрограммированию макрофагов в направлении антиангиогенного фенотипа», Научные отчеты, 9, 4281 (2019). DOI: 10.1038 / s41598-019-40903-0.
  22. ^ де Андраде CM, Рей FM, Cintra ACO, Sampaio SV, Torqueti MR (2019). «Действие кротоксина, нейротоксина из яда змеи Crotalus durissus terrificus, на эндотелиальные клетки человека», Международный журнал биологических макромолекул, 134(1), 613-621. DOI: 10.1016 / j.ijbiomac.2019.05.019.
  23. ^ а б Баррос Рибейро Г де, Алмейда ХК де, Толедо Веларде Д. (2012). «Кротоксин у человека: анализ воздействия на экстраокулярные и лицевые мышцы», Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, 75(6). DOI: 10.1590 / S0004-27492012000600002.
  24. ^ Международная заявка, опубликованная в соответствии с Договором о патентной кооперации (PCT). «Международный номер публикации: WO 2009/018643 A2», Опубликовано: 6 августа 2008 г.
  25. ^ Сартим М.А., Менальдо Д.Л., Сампайо С.В. (2018). «Иммунотерапевтический потенциал кротоксина: противовоспалительные и иммунодепрессивные свойства», Журнал ядовитых животных и токсинов, включая тропические болезни, 24(39). DOI: 10.1186 / s40409-018-0178-3.
  26. ^ Национальный институт рака. «Клинические испытания с использованием кротоксина», получено 16 марта 2020 года.