Катепсиновая зимография - Cathepsin zymography

Катепсиновая зимография представляет собой метод количественной оценки ферментативной активности цистеиновых протеаз семейства катепсинов. Он основан на SDS-PAGE, при котором образцы, проверенные на активность катепсина, загружаются в полиакриламидный гель и затем разделяются по молекулярной массе. Желатин встроен в сам гель, обеспечивая субстрат для гидролиза ферментов.

Хотя проформа катепсинов обычно стабильна, после активации протеазы, такие как катепсин К, уязвимы для инактивации в средах с нейтральным pH. Эта потеря активности затрудняет обнаружение этих ферментов. Зимография, благодаря своей высокой чувствительности и мультиплексной природе, позволяет одновременно различать несколько катепсинов. Очень небольшие количества ферментативной активности могут быть выяснены и способны разрешить фемтомоль активности катепсина К.

Протокол зимографии

Образцы тканей лизируют в буфере с добавлением лейпептина для поддержания ферментативной активности. Образцы стандартизируют по концентрации белка, а затем загружают в полиакриламидный гель для SDS-PAGE. После завершения разделения белков по молекулярной массе гель инкубируют в ренатурирующем буфере для восстановления ферментативной активности. Во время загрузки использовали невосстанавливающий буфер для сохранения белковых дисульфидных связей. После периода ренатурации гель затем инкубируют в буфере для анализа, чтобы позволить активным катепсинам протеолизовать желатин, пропитанный гелем. Этот процесс происходит в мгновение ока. На следующий день гель анализируют на наличие участков разложения желатина путем окрашивания кумасси синим. Отмечаются пятна геля, которые перестают быть синими после обесцвечивания. Эти полосы затем коррелируют с их соответствующими молекулярными массами, чтобы определить, какие катепсины были активными в образце.

Обнаружение катепсина К с помощью зимографии^[1]

Регулирование селективности катепсина

Зимографические методы обнаружения катепсинов K, L, S и V^[2]

Зимография на месте

Применение катепсиновой зимографии

Обнаружение рака

Зимография для выявления рака с катепсинами в качестве биомаркеров^[3]

Зимография на катепсин К.

Смотрите также

Рекомендации

^ Ли, Вэйвэй (2010). «Определение количества фемтомолей зрелого катепсина К с зимографией». Аналитическая биохимия. 401 (1): 91–98. Дои:10.1016 / j.ab.2010.02.035. PMID 20206119.
^ Уайлдер, Катера (2011). «Манипулирование субстратом и pH в протоколах зимографии выборочно различает активность катепсинов K, L, S и V в клетках и тканях». Архивы биохимии и биофизики. 516 (1): 52–57. Дои:10.1016 / j.abb.2011.09.009. ЧВК 3221864. PMID 21982919.
^ Чен, Бинбин (2011). «Мультиплексная зимография фиксирует профили активности катепсинов K, L и S в зависимости от стадии при раке груди, легких и шейки матки». Журнал трансляционной медицины. 9 (1): 109. Дои:10.1186/1479-5876-9-109. ЧВК 3146840. PMID 21756348.

[catKzymo-1] Ли, Вэйвэй (2010). «Определение количества фемтомолей зрелого катепсина К с зимографией». Аналитическая биохимия. 401 (1): 91–98. Дои:10.1016 / j.ab.2010.02.035. PMID 20206119.

[catKLSVzymo-2] Уайлдер, Катера (2011). «Манипулирование субстратом и pH в протоколах зимографии выборочно различает активность катепсинов K, L, S и V в клетках и тканях». Архивы биохимии и биофизики. 516 (1): 52–57. Дои:10.1016 / j.abb.2011.09.009. ЧВК 3221864. PMID 21982919.

[zymocancer-3] Чен, Бинбин (2011). «Мультиплексная зимография фиксирует профили активности катепсинов K, L и S в зависимости от стадии при раке груди, легких и шейки матки». Журнал трансляционной медицины. 9 (1): 109. Дои:10.1186/1479-5876-9-109. ЧВК 3146840. PMID 21756348.

[1]

[2]

[3]