Секвенирование CUT & RUN - CUT&RUN sequencing

CUT & RUN-секвенирование, также известен как расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы, это метод, используемый для анализа белок взаимодействие с ДНК. CUT & RUN-секвенирование сочетает нацеленное на антитело контролируемое расщепление микрококковой нуклеазой с массовым параллельным Секвенирование ДНК определить участок связывания ДНК-ассоциированных белков. Его можно использовать для точного картирования глобальных сайтов связывания ДНК для любого интересующего белка. В настоящее время, ChIP-Seq является наиболее распространенным методом, используемым для изучения отношений белок-ДНК, однако он страдает рядом практических и экономических ограничений, которых нет при секвенировании CUT & RUN.

Использует

CUT & RUN-секвенирование можно использовать для изучения регуляции генов или анализа фактор транскрипции и связывание других белков, связанных с хроматином. Взаимодействия белок-ДНК регулируют экспрессия гена и несут ответственность за многие биологические процессы и болезненные состояния. Эта эпигенетический информация дополняет генотип и анализ экспрессии. CUT & RUN - альтернатива текущему стандарту ChIP-seq. ChIP-Seq страдает ограничениями из-за стадии перекрестного связывания в протоколах ChIP-Seq, которые могут способствовать маскированию эпитопа и генерировать ложноположительные сайты связывания.[1][2] Кроме того, ChIP-seq страдает от неоптимального отношения сигнал / шум и низкого разрешения.[3] Преимущество секвенирования CUT & RUN состоит в том, что это более простой метод с меньшими затратами из-за высокого отношения сигнал / шум, требующий меньшей глубины секвенирования.[4]

Определенные участки ДНК в прямом физическом взаимодействии с белками, такими как факторы транскрипции, могут быть выделены с помощью Белок-А (pA) конъюгированный микрококковая нуклеаза (МНКаза), связанная с интересующим белком. Опосредованное МНКазой расщепление дает библиотеку сайтов-мишеней ДНК, связанных с интересующим белком на месте. Секвенирование подготовленных библиотек ДНК и сравнение с базами данных полногеномных последовательностей позволяет исследователям анализировать взаимодействия между целевыми белками и ДНК, а также различия в эпигенетических данных. хроматин модификации. Следовательно, метод CUT & RUN может применяться к белкам и модификациям, включая факторы транскрипции, полимеразы, структурные белки, модификации белков и модификации ДНК.

Рабочий процесс

Визуальное представление рабочего процесса секвенирования CUT & RUN.

CUT & RUN - это адаптация и улучшение эндогенное расщепление хроматина (ChEC), в котором используется ДНК-связывающий белок, генетически слитый с микрококковой нуклеазой (MNase). Эти слитые белки фактора транскрипции и МНКазы могут расщеплять ДНК вокруг ДНК-связывающего сайта интересующего белка.[5] В адаптированном процессе очищенная МНКаза помечается белком A (pA), который нацелен на антитело, добавленное к клетке, и специфично для интересующего ДНК-связывающего белка. Процесс CUT & RUN состоит из семи основных этапов.

Расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы

Первый необходимый шаг - это гипотонический лизис интересующих клеток для выделения ядер. Затем ядра центрифугируют, промывают в буферном растворе, образуют комплекс с лектин магнитные шарики с покрытием. Затем комплекс лектин-ядра ресуспендируют с помощью антитела, нацеленного на интересующий белок. Затем антитело и ядра инкубируют в буфере в течение приблизительно 2 часов, прежде чем ядра промывают в буфере для удаления несвязавшихся антител. Затем ядра ресуспендируют в буфере с протеин-А-МНКазой и инкубируют в течение 1 часа. Затем ядра снова промывают буфером для удаления несвязанной протеин-А-МНКазы. Затем ядра в пробирках помещают в металлический блок и помещают в ледяную воду и CaCL.2 добавляется для инициации кальцийзависимой нуклеазной активности МНКазы для расщепления ДНК вокруг ДНК-связывающего белка. Реакция протеин-А-МНКаза гасятся добавлением хелатирующих агентов (EDTA и EGTA). Затем расщепленные фрагменты ДНК высвобождаются в супернатант путем инкубации ядер в течение часа перед осаждением ядер центрифугированием. Затем фрагменты ДНК извлекаются из супернатанта и могут использоваться для создания библиотеки секвенирования.

Последовательность действий

В отличие от ChIP-Seq, выбор размера перед секвенированием не требуется. За один цикл секвенирования можно сканировать ассоциации по всему геному с высоким разрешением из-за низкого фона, достигаемого при выполнении реакции. на месте с методологией CUT & RUN-секвенирования. ChIP-Seq, напротив, требует в десять раз большей глубины секвенирования из-за высокого уровня фона, связанного с методом.[6] Затем данные собираются и анализируются с использованием программного обеспечения, которое сопоставляет последовательности образцов с известной геномной последовательностью для идентификации фрагментов ДНК CUT & RUN.[4]

Протоколы

Подробные рабочие процессы CUT & RUN доступны в репозитории методов с открытым доступом.

Чувствительность

CUT & RUN-Sequencing обеспечивает низкий уровень фонового сигнала из-за на месте профилирование, которое сохраняет in vivo 3D-подтверждения взаимодействий фактора транскрипции с ДНК, поэтому антитела получают доступ только к открытым поверхностям. Чувствительность секвенирования зависит от глубины цикла секвенирования (т. Е. Количества нанесенных на карту тегов последовательности), размера генома и распределения целевого фактора. Глубина секвенирования напрямую связана со стоимостью и отрицательно связана с фоном. Следовательно, низкофоновое секвенирование CUT & RUN по своей сути более рентабельно, чем высокофоновое ChIP-секвенирование.

Пиковое представительство для H3K27me3 целевые результаты секвенирования, сравнение CUT & RUN с традиционным ChIP. Обратите внимание: CUT & RUN, по-видимому, обеспечивает улучшенное соотношение сигнал / шум, чем традиционный чип. Это преимущество означает более низкие затраты на секвенирование.

Текущее исследование

Уже был проведен ряд исследовательских проектов, в которых использовалась новая технология CUT & RUN.

У людей исследователи, изучающие промоторы гена глобина плода, использовали CUT & RUN для исследования участия белка BCL11A в опосредовании функции области гена HBBP1,[11][12] выделение потенциальной цели для терапевтического редактирование генома для гемоглобинопатии.

Исследовательская группа использовала CUT & RUN для определения промежуточных звеньев, участвующих в нуклеосома нарушение транскрипции ДНК,[13] проверка общей стратегии структурных эпигеномика.

У людей и африканских зеленых мартышек исследователи с помощью CUT & RUN определили, что белок CENP-B (важный белок в формировании центромеры) и сайты связывания специфичны для центромер больших обезьян,[14] устранение парадокса, что CENP-B, который необходим для искусственной функции центромеры, несущественен.

Вычислительный анализ

Как и многие подходы к высокопроизводительному секвенированию, CUT & RUN-seq генерирует чрезвычайно большие наборы данных, для которых требуются соответствующие методы вычислительного анализа. Чтобы предсказать сайты связывания ДНК по данным подсчета чтения CUT и RUN-seq, пик вызова методы были разработаны.

Вызов пика - это процесс, в котором алгоритм используется для прогнозирования областей генома, с которыми связывается фактор транскрипции, путем нахождения областей генома, которые имеют множество отображенных считываний из эксперимента ChIP-seq или CUT & RUN-seq. MACS - особенно популярный алгоритм пикового вызова для данных ChIP-seq.[15] SEACR - это высокоселективный метод определения пиков, который окончательно проверяет точность CUT & RUN для наборов данных с известными истинными отрицательными значениями.[16]

Чтобы идентифицировать причинный ДНК-связывающий мотив для вызовов пиков CUT & RUN-seq, можно применить программу поиска мотивов MEME к последовательностям CUT & RUN. Это включает использование позиционно-зависимой скоринговой матрицы (PSSM) вместе с Motif Alignment and Search Tool (MAST) для идентификации мотивов в эталонном геноме, которые соответствуют полученным считываниям последовательности.[4] Этот процесс позволяет идентифицировать мотив связывания фактора транскрипции, или, если мотив связывания был ранее известен, этот процесс может действовать для подтверждения успеха эксперимента.[17]

Ограничения

Основным ограничением CUT & RUN-seq является вероятность чрезмерного переваривания ДНК из-за несоответствующего времени реакции кальций-зависимой МНКазы. Аналогичное ограничение существует для современных протоколов ChIP-Seq, где необходимо оптимизировать ферментативное или ультразвуковое срезание ДНК. Как и с ChIP-Seq, требуется антитело хорошего качества, нацеленное на интересующий белок.

Подобные методы

  • Sono-Seq: Идентичен ChIP-Seq, но без стадии иммунопреципитации.
  • ХИТС-КЛИП: Также называется CLIP-Seq, используется для обнаружения взаимодействий с РНК а не ДНК.
  • PAR-CLIP: Метод определения сайтов связывания клеточного РНК-связывающие белки.
  • RIP-чип: Подобен ChIP-Seq, но не использует методы перекрестного связывания и использует микрочип анализ вместо секвенирования.
  • SELEX: Используется для определения согласованных последовательностей связывания.
  • Конкурс-ЧИП: Измеряет относительную динамику замены в ДНК.
  • ChiRP-Seq: Измеряет ДНК и белки, связанные с РНК.
  • ЧИП-экзо: Используется обработка экзонуклеазой для достижения разрешения до одной пары оснований
  • ЧИП-нексус: Возможное улучшение ЧИП-экзо, способный обеспечить разрешение до одной пары оснований.
  • DRIP-seq: Использует антитело S9.6 для преципитации трехцепочечных гибридов ДНА: РНК, называемых R-петли.
  • TCP-seq: Принципиально похожий метод измерения динамики трансляции мРНК.
  • DamID: Использует обогащение метилированных последовательностей ДНК для обнаружения взаимодействия белок-ДНК без антител.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Мейер CA, Лю XS (ноябрь 2014 г.). «Выявление и устранение систематической ошибки в методах секвенирования нового поколения для биологии хроматина». Обзоры природы. Генетика. 15 (11): 709–21. Дои:10.1038 / nrg3788. ЧВК  4473780. PMID  25223782.
  2. ^ Баранелло Л., Кузин Ф., Сэнфорд С., Левенс Д. (май 2016 г.). «Смещение чипа как функция времени сшивания». Хромосомные исследования. 24 (2): 175–81. Дои:10.1007 / s10577-015-9509-1. ЧВК  4860130. PMID  26685864.
  3. ^ He C, Bonasio R (февраль 2017 г.). "На голову выше". eLife. 6. Дои:10.7554 / eLife.25000. ЧВК  5310838. PMID  28199181.
  4. ^ а б c Скене П.Дж., Хеникофф С. (январь 2017 г.). «Эффективная направленная нуклеазная стратегия для картирования сайтов связывания ДНК с высоким разрешением». eLife. 6. Дои:10.7554 / eLife.21856. ЧВК  5310842. PMID  28079019.
  5. ^ "Отложите чипы: вместо этого CUT & RUN". Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона. 20 февраля 2017.
  6. ^ «Все еще используете чип? Попробуйте CUT & RUN для расширенного профилирования хроматина». ЭпиСайфер. Получено 2019-07-26.
  7. ^ Янссенс, Дерек; Хеникофф, Стивен. «CUT & RUN: целевое профилирование всего генома in situ с высокой эффективностью для низкого числа клеток v3 (протоколы.io.zcpf2vn)». Дои:10.17504 / протоколы.io.zcpf2vn. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)
  8. ^ Ахмад, Ками. «CUT & RUN с тканями дрозофилы v1 (протоколы.io.umfeu3n)». Дои:10.17504 / protocol.io.umfeu3n. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)
  9. ^ Янссенс, Дерек; Ахмад, Ками; Хеникофф, Стивен. «AutoCUT & RUN: полногеномное профилирование белков хроматина в 96-луночном формате на Biomek v1 (протоколы.io.ufeetje)». Дои:10.17504 / protocol.io.ufeetje. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)
  10. ^ антитела-онлайн. "Настольный компьютер CUT & RUN с антителами - онлайн-наборы CUT & RUN (Протоколы.io.bdwni7de)". Дои:10.17504 / protocol.io.bdwni7de. Цитировать журнал требует | журнал = (Помогите)
  11. ^ Хуанг П., Келлер К.А., Джардин Б., Гревет Дж. Д., Дэвис Дж. О., Хьюз Дж. Р., Курита Р., Накамура Ю., Хардисон Р. К., Блобель Г. А. (август 2017 г.). «Сравнительный анализ трехмерной хромосомной архитектуры выявил новый регуляторный элемент гемоглобина плода». Гены и развитие. 31 (16): 1704–1713. Дои:10.1101 / gad.303461.117. ЧВК  5647940. PMID  28916711.
  12. ^ Лю Н, Харгривз В.В., Чжу К., Курланд СП, Хонг Дж., Ким В., Шер Ф, Масиас-Тревино С., Роджерс Дж. М., Курита Р., Накамура Ю., Юань Г.К., Бауэр Д.Э., Сюй Дж., Булык М.Л., Оркин Ш. ( Апрель 2018 г.). «Прямая репрессия промотора BCL11A контролирует переключение гемоглобина плода на взрослый». Ячейка. 173 (2): 430–442.e17. Дои:10.1016 / j.cell.2018.03.016. ЧВК  5889339. PMID  29606353.
  13. ^ Рамачандран С., Ахмад К., Хеникофф С. (декабрь 2017 г.). «Транскрипция и ремоделирование производят асимметрично неупакованные нуклеосомные промежуточные звенья». Молекулярная клетка. 68 (6): 1038–1053.e4. Дои:10.1016 / j.molcel.2017.11.015. ЧВК  6421108. PMID  29225036.
  14. ^ Kasinathan S, Henikoff S (апрель 2017 г.). «ДНК, отличная от B-формы, обогащена центромерами». Молекулярная биология и эволюция. 35 (4): 949–962. Дои:10.1093 / molbev / msy010. ЧВК  5889037. PMID  29365169.
  15. ^ Чжан Ю., Лю Т., Мейер К.А., Экхоут Дж., Джонсон Д.С., Бернштейн Б.Е., Нусбаум К., Майерс Р.М., Браун М., Ли В., Лю XS (2008). «Модельный анализ ChIP-Seq (MACS)». Геномная биология. 9 (9): R137. Дои:10.1186 / gb-2008-9-9-r137. ЧВК  2592715. PMID  18798982.
  16. ^ Меерс М.П., ​​Тененбаум Д., Хеникофф С. (июль 2019 г.). "Вызов пика анализом разреженного обогащения для профилирования хроматина CUT & RUN". Эпигенетика и хроматин. 12 (1): 42. Дои:10.1186 / s13072-019-0287-4. ЧВК  6624997. PMID  31300027.
  17. ^ Бейли Т., Краевски П., Ладунга И., Лефевр С., Ли К., Лю Т., Мадригал П., Таслим С., Чжан Дж. (2013). «Практическое руководство по комплексному анализу данных ChIP-seq». PLoS вычислительная биология. 9 (11): e1003326. Bibcode:2013PLSCB ... 9E3326B. Дои:10.1371 / journal.pcbi.1003326. ЧВК  3828144. PMID  24244136.