ABI Solid Sequencing - ABI Solid Sequencing

Основная статья: 2 базовая кодировка
Подготовка библиотеки для платформы SOLiD
Двухбазовая схема кодирования. При двухбазовом кодировании каждой уникальной паре оснований на 3'-конце зонда назначается один из четырех возможных цветов. Например, «AA» назначается синему, «AC» - зеленому и так далее для всех 16 уникальных пар. Во время секвенирования каждая база в шаблоне секвенируется дважды, и полученные данные декодируются по этой схеме.

Твердый (Секвенирование с помощью лигирования и обнаружения олигонуклеотидов) секвенирование ДНК следующего поколения технология, разработанная Технологии жизни и коммерчески доступна с 2006 года. Эта технология следующего поколения генерирует 108 - 109 небольшая последовательность читается за один раз. Оно использует 2 базовая кодировка для декодирования необработанных данных, созданных платформой секвенирования, в данные последовательности.

Этот метод не следует путать с «секвенированием путем синтеза», принципом, используемым Roche-454. пиросеквенирование (введено в 2005 г., генерировало миллионы операций чтения 200-400 б.п. в 2009 г.), а Солекса система (в настоящее время принадлежит Illumina) (введена в 2006 г., генерировала сотни миллионов операций чтения 50-100 б.п. в 2009 г.)

Эти методы позволили снизить стоимость с 0,01 доллара на базу в 2004 году до почти 0,0001 долларов на базу в 2006 году и увеличили производительность секвенирования с 1 000 000 баз на машину в день в 2004 году до более чем 5 000 000 000 баз на машину в день в 2009 году. Существует более 30 публикаций с описанием его использование сначала для позиционирования нуклеосом от Valouev et al.,[1] профилирование транскрипции или последовательность чувствительных к цепи РНК-Seq с помощью Cloonan et al.,[2] профилирование транскрипции отдельных клеток с помощью Tang et al.[3] и в конечном итоге ресеквенирование человека с помощью McKernan et al.[4]

Сообщается, что метод, используемый на этой машине (секвенирование путем лигирования), имеет некоторые проблемы с секвенированием палиндромных последовательностей.[5]

Химия

Библиотека фрагментов ДНК готовится из образца, подлежащего секвенированию, и используется для приготовления клональных популяций гранул. То есть на поверхности каждой магнитной бусины будет присутствовать только один вид фрагментов. Фрагменты, прикрепленные к магнитным шарикам, будут иметь присоединенную универсальную последовательность адаптера P1, так что начальная последовательность каждого фрагмента известна и идентична. Эмульсия ПЦР проходит в микрореакторах, содержащих все необходимые реагенты для ПЦР. Полученные продукты ПЦР, прикрепленные к шарикам, затем ковалентно связываются со стеклянным предметным стеклом.

Праймеры гибридизуются с последовательностью адаптера P1 в матрице библиотеки. Набор из четырех флуоресцентно меченных двухосновных зондов конкурирует за связывание с праймером для секвенирования. Специфичность зонда с двумя основаниями достигается путем опроса каждого 1-го и 2-го основания в каждой реакции лигирования. Выполняется несколько циклов лигирования, обнаружения и расщепления, количество циклов определяет конечную длину считывания. После серии циклов лигирования продукт удлинения удаляют, а матрицу сбрасывают с помощью праймера, комплементарного положению n-1 для второго раунда циклов лигирования.

Для каждой метки последовательности завершается пять раундов сброса праймера. Посредством процесса сброса праймера каждое основание опрашивается в двух независимых реакциях лигирования двумя разными праймерами. Например, основание в позиции считывания 5 анализируется праймером номер 2 в цикле лигирования 2 и праймером номер 3 в цикле лигирования 1.

Пропускная способность и точность

Согласно ABI, платформа SOLiD 3plus дает 60 гигабаз пригодных для использования данных ДНК за цикл. Благодаря двум базовым системам кодирования в технологию встроена внутренняя проверка точности, которая обеспечивает точность 99,94%. Химический состав систем также означает, что гомополимеры не препятствуют ему, в отличие от системы Roche 454 FLX, и поэтому большие и сложные области гомополимерных повторов больше не являются проблемой для секвенирования.

Приложения

Естественно, эта технология будет использоваться для секвенирования ДНК, но из-за высокой параллельности всех технологий следующего поколения они также найдут применение в транскриптомика и эпигеномика.

Микрочипы когда-то была основой транскриптомики последние десять лет, и технология на основе массивов впоследствии распространилась на другие области. Однако они ограничены тем, что можно получить информацию только для датчиков, которые находятся на микросхеме. Можно получить только информацию об организмах, для которых доступны чипы, и они связаны со всеми проблемами гибридизации большого количества молекул (разные температуры гибридизации). Транскриптомика RNA-Seq при секвенировании следующего поколения будет означать, что эти барьеры больше не действуют. Весь транскриптом любого организма может быть потенциально секвенирован за один прогон (для очень маленьких бактериальных геномов), и будет доступна не только идентификация каждого транскрипта, но и профилирование экспрессии, поскольку также может быть достигнуто количественное считывание.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP) - это метод определения сайтов связывания факторов транскрипции и ДНК-белковых взаимодействий. В прошлом он с некоторым успехом сочетался с технологией массивов (ChIP-chip). В этой области также может применяться секвенирование следующего поколения. Иммунопреципитация метилированием (MeDIP) также может выполняться на массивах.

Возможность узнать больше о сайтах метилирования и связывания TF в масштабе всего генома является ценным ресурсом и может многому научить нас о болезнях и молекулярной биологии в целом.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Валуев А., Итикава Дж., Тонхат Т. и др. (Июль 2008 г.). «Карта положения нуклеосом C. elegans с высоким разрешением демонстрирует отсутствие универсального позиционирования, определяемого последовательностью». Геномные исследования. 18 (7): 1051–63. Дои:10.1101 / гр.076463.108. ЧВК  2493394. PMID  18477713.
  2. ^ Клунан Н., Форрест А.Р., Колле Г. и др. (Июль 2008 г.). «Профилирование транскриптома стволовых клеток с помощью массового секвенирования мРНК». Природные методы. 5 (7): 613–9. Дои:10.1038 / nmeth.1223. PMID  18516046.
  3. ^ Тан Ф., Барбачору С., Ван И и др. (Май 2009 г.). «Анализ целого транскриптома мРНК-Seq отдельной клетки». Природные методы. 6 (5): 377–82. Дои:10.1038 / nmeth.1315. PMID  19349980.
  4. ^ МакКернан К.Дж., Пекхэм Х.Э., Коста Г.Л. и др. (Сентябрь 2009 г.). «Последовательность и структурные вариации в геноме человека, выявленные короткочитаемым, массивно параллельным секвенированием лигирования с использованием двухосновного кодирования». Геномные исследования. 19 (9): 1527–41. Дои:10.1101 / гр.091868.109. ЧВК  2752135. PMID  19546169.
  5. ^ Ю-Фэн ​​Хуан; Шэн-Чунг Чен; И-Шиен Чан & Цзы-Хан Чен (2012). «Палиндромная последовательность препятствует механизму секвенирования путем лигирования». BMC Системная биология. 6 Приложение 2: S10. Дои:10.1186 / 1752-0509-6-S2-S10. ЧВК  3521181. PMID  23281822.

дальнейшее чтение